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1、SDS-PAGE凝膠電泳,SDS-PAGE凝膠電泳,實驗原理 實驗步驟 注意事項 SDS-PAGE的優(yōu)點 SDS-PAGE的缺點 實驗常見問題及處理 小技巧,實驗步驟,試劑配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉） （3）1.5mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)： 稱取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8,最后用蒸餾水定容至100ml。,（4）1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8): 稱取Tris
2、12.1g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最后用蒸餾水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)：稱取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0,最后用蒸餾水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺）,（）樣品溶解液： SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻 （）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用
3、,（1）脫色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml （1）電極緩沖液 （內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml,. 聚膠前準(zhǔn)備,(1) 配制10過硫酸銨溶液(需每天新鮮配制)。 (2) 將單體儲存液、緩沖液、水按照一定比例配制成凝膠溶液。 (3) 將灌膠裝置準(zhǔn)備好。 (4) 待凝膠溶液平衡至室溫(2325)后，真空脫氣15 min。,不連續(xù)系統(tǒng)下層分離膠的聚合,在10 ml凝膠溶液中加入10過硫酸銨50 l (最終濃度為0.
4、05)，TEMED原液5l (最終濃度為0.05)。輕緩地?fù)u動溶液(810下)，使激活劑混合均勻。 將凝膠溶液平穩(wěn)地注入兩層玻璃板中(注意要以連續(xù)平穩(wěn)的液流從中間位置注入)，再在液面上小心注入一層水或正丁醇(約23mm高)，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置至少90 min。,不連續(xù)系統(tǒng)中的上層濃縮膠 和連續(xù)系統(tǒng)凝膠的聚合,連續(xù)系統(tǒng)只含一種凝膠，它和不連續(xù)系統(tǒng)中的濃縮膠具有相同之處，即在其液面處與空氣相接觸，因此激活劑的含量應(yīng)相應(yīng)地增加，在10m1凝膠溶液中加入10過硫酸銨50 l (最終濃度0.05)，TEMED原液10 l (最終濃度0.1)。,同前將激活劑混合均勻，但搖動溶液時不要搖得過
5、于劇烈以免引入過多的氧氣。 吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡。 靜置90 min以上以保證完全聚合。 如果在聚膠過程中發(fā)現(xiàn)一道道紋線，即凝膠不均勻，可能是聚合速度太快或激活劑未充分混合導(dǎo)致局部濃度過高。,凝膠聚合的速度可以通過紫外吸收檢測，由于丙烯酰胺中的雙鍵在260nm有吸收，聚合后雙鍵消失，光吸收減低。將凝膠溶液倒入石英比色杯中，可觀察到2030 min后光吸收讀數(shù)開始下降，至80 min以后趨于穩(wěn)定，說明聚合完成。,電泳,將聚合好的凝膠板安置于電泳槽中，上樣，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳。,垂直板電泳裝置,加樣,樣品遷移
6、方向,水平式電泳裝置,電泳緩沖液,凝膠,電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。,混合樣品,帶孔膠,按分子大小分離,電泳方向,電泳,小分子,大分子,染色和脫色,電泳完畢需通過染色和脫色評定其結(jié)果的優(yōu)劣，此外根據(jù)不同的研究目的，也可將凝膠直接進(jìn)行放射自顯影及電印跡。,電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片,.結(jié)果處理,測量并計算分子量 蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)37種蛋白的測定得到以下的關(guān)系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (2) 其中MW是蛋白質(zhì)分子量；K和K1為常數(shù) b為斜
7、率，m是電泳遷移率，實際使用的是相對遷移率mR。 mR=dpr/dBPB,夾在兩塊玻璃板之間的凝膠,電泳緩沖液,電泳緩沖液,加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品,分子量小,分子量大,電源,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。,相對遷移率,實驗注意事項,1. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：丙烯酰胺、線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。 2. 注意不能隨便傾倒單體溶液，應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無
8、毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。,3. TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。,4. 過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。,5. 激活劑的用量: 激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將
9、使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。,6. 溫度的影響聚膠的最佳溫度為2325 ，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有時從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時快。,7. 氧氣的影響氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑
10、得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度(125torr)脫氣至少15 min 。,8. 凝膠添加劑：凝膠中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加劑。SDS加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。,9. 聚膠時間：雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMED催化后灌膠1520 min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證95以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時聚膠時間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時間(完全聚合需8 h)。,10. 單體的濃度：是指單體總
11、重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可選擇的范圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。,12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且SDS-PAGE測定分子量有10誤差，不可完全信任。 13. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。,14. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）
12、組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。 15. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。,常見問題及處理辦法,紋理和拖尾現(xiàn)象由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。 蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。,電泳時間比正常要長 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯誤。 指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不
13、同的遷移率。,.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全 .凝膠時間不對通常膠在30min內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，AP試劑不夠或者失效,7.出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起） 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。,8.出現(xiàn)“鬼帶” 如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而
14、失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。,9.為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。,SDS-PAGE的優(yōu)點,設(shè)備簡單 快速 分辨率和靈敏度高 特別適用于寡聚蛋白及其亞基
15、的分析鑒定和分子量的測定,SDS-PAGE的缺點,1. 有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。,SDS-PAGE的缺點,2. 還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們在SDS-凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對數(shù)不呈線性關(guān)系。因此，為了測得真實和完整的蛋白質(zhì)分子量，通?？刹捎枚喾N方法進(jìn)行測定和相互驗證。,
16、小技巧,1： 電泳緩沖液的使用： 電泳緩沖液是完全可以回收再用的，但前提是每次的內(nèi)層緩沖液必須是新配的。每次在電泳完成后內(nèi)外層緩沖液一起回收到一個瓶里，作為下次的外層緩沖液使用。就是配制新的緩沖液只作為內(nèi)層使用（配制1L可以用很久的），每次都用回收的緩沖液作外層，效果一點都不差，即節(jié)省了試劑，又節(jié)省了時間。,2： 電泳條件的選則 電泳不采用先低壓再高壓的常用方法，每次都是上樣后直接采用200V恒壓電泳，一般BioRad的膠板，39min即可跑到頭，電泳結(jié)果一點都沒有影響。,3： 染色與脫色 分子克隆上介紹的方法耗時太長，現(xiàn)在用Crystal的方法已經(jīng)相當(dāng)快了，稍做改動：染色時加入染液后，在微波爐中煮沸一次即可，切記不要噴了，這個過程大約2030秒，在搖床上染色，這時可以去處理膠板，電泳槽，臺面，待收拾干凈后染色也就結(jié)束了（不要覺得染色時間太短了，已經(jīng)足夠了，太長了脫色也麻煩），此過程大約需要35min；回收染液，用自來水清洗幾次膠，再加入適量自來水，放入微波爐中煮沸，條件與染色時一致，搖床脫色，此時你就可以做其他試驗了， 35min后可以再換一次清水，煮沸脫色，我的經(jīng)驗是一次用水脫色就可以看到Marker條帶了，兩次以后就可以清析的看到你的結(jié)果了，如果覺得結(jié)果不錯可以留存?zhèn)溆?，再加入脫色液，脫干凈了就行了?Thanks For Your Attention!,
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