動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)新醫(yī)學PPT

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動物細胞融合,單克隆抗體技術(shù),動物細胞核移植,（基礎(chǔ)）,在治療燒傷病人時，通常采用的方法是取燒傷病人健康皮膚進行自體移植。但對于一個大面積燒傷的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。,動物細胞培養(yǎng)技術(shù),那么，怎么才能獲得大量的自體健康皮膚呢？,1、概念：,就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。,2、原理：細胞增殖,（有絲分裂）,概念：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。,胰蛋白酶/膠原蛋白酶處理,取出組織塊,胚胎或幼齡動物器官組織,,剪碎,單個細胞,細胞懸液,,,,①原代培養(yǎng),,細胞懸液,,,,CO2培養(yǎng)箱,增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng),3.過程,加培養(yǎng)液,特點： ①細胞貼壁生長，長成單層細胞； ②有接觸抑制現(xiàn)象；,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行原代培養(yǎng),貼壁過程,細胞貼壁：,培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：,內(nèi)表面光滑、無毒、無菌、易于貼附,在培養(yǎng)瓶懸液中分散培養(yǎng)的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。,①原代培養(yǎng)特點,當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。,細胞的接觸抑制,①原代培養(yǎng)特點,接觸抑制：,,②傳代培養(yǎng)（擴大培養(yǎng)）,CO2培養(yǎng)箱,當原代培養(yǎng)的細胞處于接觸抑制后, 用胰蛋白酶處理,使細胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi),這個過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）,分瓶擴大培養(yǎng)： 以1:2或l:3以上的比率進行分裝,,10—50代細胞,無限傳代,分瓶,胰蛋白酶,原代培養(yǎng)接觸抑制,,1—10代細胞,,,,傳代培養(yǎng),單層細胞,細胞核型保持正常,多層細胞,細胞突變核型改變,①第 一次危機,②第 二次危機,部分細胞核型可能改變,癌細胞（不死性，無限增殖，失去接觸抑制，易轉(zhuǎn)移）,②傳代培養(yǎng)特點,單層細胞,,每分瓶擴大培養(yǎng)一次為一次傳代；傳代代數(shù)就是分瓶次數(shù)； 每一代的細胞培養(yǎng)，從細胞貼壁到貼滿瓶壁過程中，細胞分裂了很多次；,思考題,傳代培養(yǎng)中,傳代代/次數(shù)與細胞增殖/分裂次數(shù)是否相同？,,1.為何動物細胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個細胞的呢？,成塊的組織細胞靠在一起,彼此限制了細胞的生長和增殖，也不利于細胞營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝廢物的排出。,思考題,2.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細胞間的物質(zhì)是什么成份？能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？,①胰蛋白酶水解蛋白質(zhì),②細胞間的成分是蛋白質(zhì),③不能，因為兩者的最適pH不同,④胰蛋白酶長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，因此必須控制好胰蛋白酶的處理時間。,4.傳代培養(yǎng)的細胞能一直傳代下去嗎？,5.有些為何能一直傳下去？,不都能。傳代培養(yǎng)到50代左右的時候，大部分的細胞都停止分裂，最終衰老死亡；但有少數(shù)細胞能夠繼續(xù)傳代。,這些發(fā)生突變，獲得不死性，朝著癌細胞方向發(fā)展（成為了癌變細胞）,3.如果培養(yǎng)的細胞數(shù)量并未達到人們的需求，應(yīng)該怎樣辦？,用胰蛋白酶處理將貼滿瓶壁的細胞分離下來，然后分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)）,8.動物細胞培養(yǎng)能否像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)出新個體？,不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能形成新的動物個體,7.動物細胞培養(yǎng)就是為了得到這些細胞嗎？,可以得到細胞，也可以得到細胞產(chǎn)物,6.人類一般保存的是哪類細胞呢？為什么？,保存10代以內(nèi)的細胞，可以保持細胞正常的二倍體核型；而10代以后的細胞核型可能發(fā)生變化，有少部分還發(fā)生突變向癌細胞方向發(fā)展,4.動物細胞培養(yǎng)條件,1.無菌、無毒的環(huán)境,①對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行無菌處理； ②在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素； ③定期更換培養(yǎng)液；,2.營養(yǎng),葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素等,+ 動物血清或血漿,3.溫度和pH,溫度36.5±0.5度，pH7.2～7.4,4.氣體環(huán)境,95%空氣和5% CO2（CO2培養(yǎng)箱提供）,合成培養(yǎng)基,不能用胃蛋白酶代替胰蛋白酶,O2是細胞代謝所必需的；,CO2維持培養(yǎng)液的pH,獲得細胞,細胞的全能性,細胞或細胞產(chǎn)品,新的個體或細胞產(chǎn)品,培養(yǎng)結(jié)果,或細胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無病毒植株等,培養(yǎng)目的,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細胞增殖,原 理,動物細胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項目,植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較,葡萄糖等、,動物血清,5.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:,1.生產(chǎn)生物制品 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 2.應(yīng)用于基因工程 主要用于作為受體細胞 3.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 4.細胞的生理、藥理、病理研究 如用于篩選抗癌藥物,1.用于動物細胞培養(yǎng)的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞（ ?。? A.容易產(chǎn)生各種變異 B.具有更強的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力強,【隨堂練習】,D,2.動物細胞培養(yǎng)的特點（ ） ①細胞貼壁 ②有絲分裂 ③細胞分化 ④接觸抑制 ⑤減數(shù)分裂 ⑥原代培養(yǎng)一般傳代1~~10代 A、①②④⑥ B、②③④⑤ C、①③④⑥ D、③④⑤⑥,A,3.下列屬于動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)主要區(qū)別的是（ ） A.培養(yǎng)基成分不同 B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能 D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株,A,C項：愈傷組織條件適宜可以傳代培養(yǎng)不分化（擴大培養(yǎng)） D項：正因為C項，因此植物細胞也可以培養(yǎng)成大量細胞,4.回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題： （1）在動物細胞培養(yǎng)過程中，當貼壁細胞分裂生長到細胞表面 時，細胞會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的 。此時，瓶壁上形成的細胞層數(shù)是 。要使貼壁的細胞從瓶壁上分離下來，需要用酶處理，可用的是 。 （2）隨著細胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現(xiàn) 的現(xiàn)象；但極少數(shù)細胞可以連續(xù)增殖，這些細胞因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成 細胞，該種細胞的黏著性 ，細胞膜表面蛋白質(zhì)（糖蛋白）的量 。,相互接觸,接觸抑制,單層,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性/癌,降低,減少,（3）檢查某種毒物是否能改變細胞染色體的數(shù)目，最好選用細胞分裂到 期的細胞用顯微鏡進行觀察。 （4）給患者移植經(jīng)細胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因為機體把移植的皮膚組織當作 進行攻擊。,中,抗原,植物組織培養(yǎng)中，外植體在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件誘導下，可形成完整的植株。,想一想,那么，離體的動物組織細胞也能夠通過一定的誘導，發(fā)育成一個完整的動物體嗎？,①分化潛能變?nèi)酰? 其全能性隨著細胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變?nèi)酢? （這是對整體細胞而言）,②細胞核仍具有全能性： 細胞核，含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細胞分化而丟失基因，因此高度分化細胞的細胞核仍具有全能性。,對于動物細胞來說：,根據(jù)動物細胞核仍具有全能性的特點，怎樣將動物細胞的全能性表現(xiàn)出來?,克隆動物的獲得，實際上利用核移植技術(shù)來實現(xiàn)的,想一想,二.動物細胞核移植技術(shù)和克隆動物,將動物細胞(供體)的一個細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞(受體)中，使其重組(重組細胞)并發(fā)育成為一個新的胚胎(重組胚胎)，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）。,1.動物細胞核移植概念：,(難度高；成功率低),P51核移植技術(shù),采集卵母細胞,供體奶牛,,,2.體細胞核移植的過程：,供體細胞（供核）,,細胞培養(yǎng),體細胞,卵巢卵母細胞（MⅡ中期：供質(zhì)）,去核,無核卵母細胞,,注入,,,細胞融合,重組細胞,,構(gòu)建重組胚胎,,胚胎移植,代孕母體,,生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛,2.共分成兩大階段：核移植和胚胎移植,2.體細胞核移植的過程：,,動物細胞培養(yǎng)、核移植、胚胎移植,1.整個過程用了哪些技術(shù)？,1.原理？,2.體細胞核移植的過程：,動物細胞核的全能性,2.繁殖方式？,無性繁殖（克隆）,3.有人說它上述的克隆牛有三個母親，對嗎？,4.新生牛的性別、基因？,性別與供體相同、基因與供體的基本相同,5.體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？,不是?？寺游锏男誀钆c核供體生物的性狀基本相同，而不是完全形同。因為克隆動物的細胞質(zhì)遺傳物質(zhì)來自于受體卵母細胞。此外，生物的性狀還受環(huán)境的影響。,供體親本：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛（供核）,受體親本：普通奶牛（提供去核卵母細胞）,代孕親本：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛,7.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？,為使核移植動物的核遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細胞。,6.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？,10代以內(nèi)的細胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變。,8.為什么受體細胞選取減數(shù)第二次分裂中期（MⅡ期）的卵母細胞？,它是最大的細胞，細胞核的位置靠近第一極體，用微吸管可以將其細胞核和第一極體吸去，易操作。含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件（它發(fā)育可直接表達性狀）。,①物理方法： 電脈沖等 ②化學方法： 鈣離子載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等,電刺激,11.激活重組細胞的方法：,9.促進供體細胞和受體細胞細胞融合的方法：,10.對重組細胞進行激活的目的：,激活受體細胞，使其完成細胞分裂和發(fā)育過程,（三）體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,1、畜牧業(yè)方面：,2、醫(yī)藥衛(wèi)生方面：,可以加速家畜遺傳改良的進程，促進優(yōu)良畜群繁育,保護瀕危物種，增加其存活數(shù)量,轉(zhuǎn)基因的克隆動物：生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)；用作器官移植的供體；,3、其他領(lǐng)域,了解胚胎發(fā)育及衰老過程,用克隆動物作為疾病模型，更好追蹤研究疾病的發(fā)展過程、治療疾病,1)成功率很低 代孕母體產(chǎn)下的活的克隆動物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。 2)克隆動物存在健康問題 許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大、異常肥胖、發(fā)育困難、臟器缺陷、免疫缺陷等。 3)克隆技術(shù)的各個環(huán)節(jié)有待進一步改進 4)對克隆動物產(chǎn)品的安全性存在爭議,4、體細胞核移植存在的問題,1.下列關(guān)于體細胞克隆的敘述，錯誤的是（ ） A 供體為體細胞的細胞核 B 受體為去核卵母細胞的細胞質(zhì) C 細胞核移植是體細胞克隆的關(guān)鍵步驟 D 克隆出的后代與供體的遺傳物質(zhì)和表現(xiàn)型完全一致,D,隨堂練習,2.動物細胞體外培養(yǎng)時，通常要在培養(yǎng)基中補充一定濃度的某些物質(zhì)。下圖是血清對正常細胞和癌細胞培養(yǎng)影響的實驗結(jié)果。從該圖提供的信息可以獲得的結(jié)論，錯誤是（ ）,A．正常細胞與癌細胞的增殖速率相同 B．有無血清對正常細胞培養(yǎng)的影響不同 C．培養(yǎng)基中補充血清有助于正常細胞的培養(yǎng) D．培養(yǎng)基中是否補充血清對癌細胞的培養(yǎng)影響不大,A,3.下列有關(guān)體細胞核移植技術(shù)的說法不正確的是 ( ) A.體細胞核移植技術(shù)在多種動物中獲得了成功，成功率非常高 B.克隆技術(shù)的各個環(huán)節(jié)有待于進一步改進 C.大多數(shù)克隆動物還存在一些遺傳和生理缺陷類的健康問題 D.克隆動物食品的安全性問題仍然存有爭議,A,4.下列哪項不屬于體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用（ ） A.加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育 B.保護瀕危物種 C.獲得組織器官異體移植的供體 D.大量產(chǎn)生紫杉醇,D,