【基金標(biāo)書】2011CB100700-植物免疫機(jī)制與作物抗病分子設(shè)計(jì)的重大基礎(chǔ)理論

項(xiàng)目名稱： 植物免疫機(jī)制與作物抗病分子設(shè)計(jì)的重大基礎(chǔ)理論首席科學(xué)家： 何祖華 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部門： 中國科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部二、預(yù)期目標(biāo)（一）項(xiàng)目總體目標(biāo)深入闡明重要糧食作物的免疫機(jī)理、建立我國主要農(nóng)作物重大病害抗病機(jī)制為模式的創(chuàng)新研究體系，結(jié)合我國轉(zhuǎn)基因新品種培育的重大戰(zhàn)略需求，建立作物抗病分子設(shè)計(jì)的理論與技術(shù)體系。本項(xiàng)目將系統(tǒng)分離并鑒定重要糧食作物水稻和麥類新的抗病基因（包括QTL） 、病原菌致病因子的寄主靶標(biāo)、模式植物擬南芥的重要調(diào)控基因及其在作物中的相應(yīng)功能等，建立我國特色的分子植物病理學(xué)前沿理論研究模型，開辟植物免疫研究的國際前沿，前瞻性地布局國際前沿的創(chuàng)新研究領(lǐng)域與技術(shù)體系。在植物新的免疫機(jī)制、作物廣譜持久抗病的分子遺傳機(jī)制、作物重要腐生?。ㄈ缂y枯?。┑目共⌒缘确矫娅@得重大突破，并以此為基礎(chǔ)建立重要糧食作物抗病分子設(shè)計(jì)的重大基礎(chǔ)理論和技術(shù)體系。本項(xiàng)目將在農(nóng)作物抗病性的基礎(chǔ)理論上做出創(chuàng)新性貢獻(xiàn)，為作物抗病育種提供具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新策略、新技術(shù)和基因資源。本項(xiàng)目的實(shí)施將在高水平研究論文發(fā)表、專利申請和優(yōu)秀人才培養(yǎng)與團(tuán)隊(duì)建設(shè)等方面做出重大貢獻(xiàn)，大幅提高我國的農(nóng)業(yè)科學(xué)理論與技術(shù)水平，實(shí)現(xiàn)跨越式發(fā)展，顯著增強(qiáng)我國農(nóng)業(yè)科學(xué)自主創(chuàng)新的能力，為國家“轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)” 的高效實(shí)施提供理論與技術(shù)體系的保障。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 建立水稻和麥類作物免疫研究的前沿體系以水稻為代表的農(nóng)作物與擬南芥相比，它們的免疫分子機(jī)理既有相似性，但在抗病基因的結(jié)構(gòu)和功能、對病原菌 PAMP 和 effector 識別應(yīng)答及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)等方面存在重要差異，并存在較多的技術(shù)障礙，重要的研究體系也沒有很好建立。本項(xiàng)目將立足于領(lǐng)域前沿與國家需求，分別把水稻和小麥的重要抗病系統(tǒng)的研究進(jìn)一步發(fā)展成為全面、成熟、具有國際前沿水平的植物抗病分子機(jī)理研究的模式體系；并初步建立對頑拗性腐生病原菌紋枯?。⒖萁z核菌）和赤霉病（禾谷鐮孢）免疫研究的技術(shù)平臺與重要的抗病相關(guān)基因資源，全面揭示宿主農(nóng)作物對腐生性病原侵染的應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)和免疫機(jī)制，為分子植物病理學(xué)科的發(fā)展和作物抗病分子育種提供新的理論和途徑。2. 深化植物免疫研究的模式和內(nèi)容，開辟國際領(lǐng)先的研究新領(lǐng)域本項(xiàng)目課題組在近幾年已在擬南芥的 PTI 和 ETI，SAR，及其交互作用（cross-talk）做出了系列的國際水平的研究成功，項(xiàng)目的實(shí)施將進(jìn)一步建立合作團(tuán)隊(duì)，凝練主攻方向，在植物 ETI 的新機(jī)制、ETI-PTI 交互作用、新的 SAR 調(diào)控因子上建立國際領(lǐng)先的研究領(lǐng)域，獲得系列重要研究成果。3. 創(chuàng)建植物免疫表觀遺傳調(diào)控研究新體系目前植物免疫的表觀遺傳機(jī)制研究剛剛起步，若干重要問題亟待解決。本項(xiàng)目將利用相關(guān)課題組已經(jīng)建立的國際前沿植物 RNA 沉默及抗病毒分子機(jī)理的研究水平的基礎(chǔ)上，鑒定新的表觀遺傳因子與作用機(jī)制，系統(tǒng)研究植物中 RNA沉默介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制在植物免疫中的新的調(diào)控功能；建立重要作物病害如黃單胞菌（白葉枯病）對水稻 siRNA 的調(diào)控的全基因組網(wǎng)絡(luò)，闡明植物 miRNAs是否通過調(diào)控 R 基因直接參與植物抗病反應(yīng)，在新的層面上認(rèn)識植物免疫的RNA 沉默途徑的應(yīng)答機(jī)制，建立創(chuàng)新的植物免疫研究理論與技術(shù)體系，在農(nóng)作物抗病的理論和轉(zhuǎn)基因抗病新技術(shù)上取得新的突破。4. 剖析作物抗病性與產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，建立學(xué)科交叉領(lǐng)域以水稻抗病反應(yīng)與發(fā)育的交互作用為模式系統(tǒng)，闡明水稻 SAR 基因 OsNPR1如何調(diào)控生長素發(fā)育途徑，從而調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量性狀的分子機(jī)制；闡明 ET 發(fā)育途徑參與水稻稻瘟病抗性的分子機(jī)理；闡明以水稻病毒?。≧DV 和水 RBSDV)侵染植物導(dǎo)致植物矮化的分子機(jī)理，為病毒防治尋找新的途徑；建立新的作物抗病與發(fā)育交叉研究領(lǐng)域，在學(xué)科創(chuàng)新上有持續(xù)的生命力。5. 系統(tǒng)發(fā)掘作物重要抗病新基因，解析新的抗性機(jī)制目前從水稻和小麥中克隆的抗病基因數(shù)量非常有限，極大部分抗病基因還未知。 這對于全面理解作物與病原菌的相互作用及抗病機(jī)制是主要的限制因素。尤其是對廣譜持久抗病性的分子機(jī)制基本上是空白。此外，對于類似紋枯病這樣的水稻病害，其危害已越來越嚴(yán)重，但在水稻中迄今尚未鑒定有重要抗性的基因位點(diǎn)。本項(xiàng)目將系統(tǒng)克隆 30-50 個水稻抗病基因（尤其是廣譜持久抗病基因）、麥類慢銹病抗病主效 QTL 等、以及重要的抗病調(diào)控基因，系統(tǒng)剖析這些新抗病基因的抗性機(jī)制，尤其將在克隆水稻廣譜抗病基因 ROD1、 Pigm、小麥慢條銹苗期主效數(shù)量抗性基因 Yrq1 及大麥慢葉銹成株期主效數(shù)量抗性基因Rphq4 的基礎(chǔ)上，確定其在免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中所承擔(dān)的功能，提出植物廣譜持久抗病性遺傳與分子機(jī)理的模型，也為接續(xù)的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。6. 創(chuàng)立并實(shí)踐作物抗病分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)理論與技術(shù)體系本項(xiàng)目將整合上述基礎(chǔ)理論和基因資源，解決抗病分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵科學(xué)問題，包括：優(yōu)異等位或同源抗病基因的開發(fā)、基因簇內(nèi)復(fù)等位基因的重組和功能評價；新型抗病基因的分子設(shè)計(jì)和功能評價；抗病基因的聚合轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)育及其功能評價。本項(xiàng)目將率先建立水稻和小麥抗病分子設(shè)計(jì)的實(shí)踐模型，發(fā)展 2-3 種農(nóng)作物抗病改良的新策略，為廣泛開展作物抗病分子設(shè)計(jì)育種奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。通過科學(xué)的分子手段，結(jié)合傳統(tǒng)育種手段對農(nóng)作物栽培品種進(jìn)行遺傳改良，得到抗病性顯著改良和廣譜抗病的水稻、小麥等農(nóng)作物的品系 7-10 個，獲得 2-3個能夠抗水稻紋枯病、病毒病等疑難病害的農(nóng)作物品（株）系。7. 創(chuàng)造系列高水平的研究成果，大幅提升我國在本領(lǐng)域的國際地位在國內(nèi)外核心刊物上發(fā)表研究論文 100 篇左右。其中，在國際一流學(xué)術(shù)期刊（IF > 8.0）上發(fā)表論文 1015 篇，申請發(fā)明專利 2030 項(xiàng)，授權(quán)專利710 個，主辦一次大型專業(yè)國際學(xué)術(shù)會議，大幅提升我國科研團(tuán)隊(duì)在國際上的研究地位。8. 全面推進(jìn)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)依托項(xiàng)目實(shí)施，進(jìn)一步凝練我國在植物免疫和作物抗病分子領(lǐng)域的戰(zhàn)略目標(biāo)，培養(yǎng)一批具有科學(xué)創(chuàng)新精神和在專業(yè)領(lǐng)域具有較高國際顯示度的中青年學(xué)科帶頭人，建設(shè)具有國際一流水平的研究隊(duì)伍。培養(yǎng)博士后和研究生 150 名左右，為我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展奠定人才基礎(chǔ)。三、研究方案（一）總體學(xué)術(shù)思路本項(xiàng)目緊密結(jié)合農(nóng)業(yè)生物學(xué)學(xué)科前沿，并為保障我國糧食生產(chǎn)安全和支撐國家轉(zhuǎn)基因新品種培育等重大戰(zhàn)略需求，建立以我國主要農(nóng)作物重大病害抗病機(jī)制為模式的創(chuàng)新研究體系。在研究思路上強(qiáng)調(diào)頂層設(shè)計(jì)與整合，以“一線四點(diǎn)六面” 的格局組織項(xiàng)目的實(shí)施，即：1 條主線，4 個關(guān)鍵科學(xué)問題，6 方面研究內(nèi)容。在具體研究體系上，針對重要的作物-病害體系包括水稻和麥類病害的新抗病基因和調(diào)控基因的克隆與功能機(jī)制，并整合與創(chuàng)新模式植物擬南芥的前沿免疫研究體系。在技術(shù)路線上廣泛采用正向、反向遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)，并結(jié)合生物信息學(xué)、蛋白-蛋白相互作用、蛋白組學(xué)、現(xiàn)代生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等研究技術(shù)。在目標(biāo)集成上，剖析作物對重要病原菌的識別機(jī)制與應(yīng)答的信號網(wǎng)絡(luò)，研究作物廣譜與持久抗性尤其是數(shù)量性狀（QTL）抗性的分子機(jī)制，分析與整合作物抗病性與產(chǎn)量性狀的互作途徑，并緊密結(jié)合作物遺傳育種，建立作物抗病分子設(shè)計(jì)的理論、應(yīng)用基礎(chǔ)和共性技術(shù)體系。（二）總體技術(shù)途徑目前組學(xué)和復(fù)雜性狀 的研究方法已貫穿到生物學(xué)研究的各個方面，根據(jù)總體研究目標(biāo)和目前學(xué)科的發(fā)展趨勢，本項(xiàng)目將針對農(nóng)作物與病原微生物相互作用過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，充分利用遺傳學(xué)和表觀遺傳、植物病理學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究手段，將植物-病原菌的功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)等精密結(jié)合，以嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)分析，解析和闡明植物免疫的細(xì)胞、生化與分子過程。因此，本項(xiàng)目將發(fā)展和利用以下相互交織的技術(shù)平臺：1. 充分運(yùn)用遺傳學(xué)與基因組學(xué)平臺，鑒定重要的抗病或免疫調(diào)控因子。利用作物抗病資源和大規(guī)模突變體篩選，定位克隆重要的抗病基因（包括 QTL）和關(guān)鍵調(diào)控基因，分析抗病等位基因的結(jié)構(gòu)與功能差異，并利用植物轉(zhuǎn)化和基因敲除（knockout/knockdown）等驗(yàn)證基因功能；利用蛋白質(zhì)互作和蛋白組學(xué)等技術(shù)，鑒定重要的互作蛋白或靶蛋白等；利用表達(dá)組學(xué)結(jié)合基因功能分析，分離鑒定重要的免疫調(diào)節(jié)基因。2. 建立表觀遺傳分析技術(shù)體系和遺傳資源，分析表觀遺傳機(jī)制對植物免疫的調(diào)控，鑒定有調(diào)控功能的 sRNA 及其靶標(biāo)基因。3. 利用生物信息分析平臺，對大規(guī)模植物和病原菌基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列分析和基因挖掘鑒定重要的免疫/抗病調(diào)控因子、 響應(yīng)因子和路徑節(jié)點(diǎn)等，分析重要病原的致病性基因簇結(jié)構(gòu)及其寄主靶標(biāo)，預(yù)測抗病蛋白的結(jié)構(gòu)和互作模式，并根據(jù)重要的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4. 利用激光微切割技術(shù)結(jié)合基因芯片和生物信息學(xué)分析平臺，精確分離鑒定細(xì)胞特異和侵染早期的寄主響應(yīng)基因，尤其是對腐生菌(小麥赤霉病)的抗病相關(guān)基因，建立防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。5. 建立和利用細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)平臺，包括各種顯微觀察方法、標(biāo)記與跟蹤技術(shù)、免疫共沉淀、體內(nèi)外生化活性分析等技術(shù)，驗(yàn)證重要的植物免疫細(xì)胞學(xué)過程，分離重要的活性小分子，抗病的激素途徑及其與產(chǎn)量性狀等的關(guān)聯(lián)。6. 將分子遺傳、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和作物育種學(xué)結(jié)合，進(jìn)行抗病分子設(shè)計(jì)育種，選育廣譜抗病水稻和小麥品系，建立分子設(shè)計(jì)育種的理論與技術(shù)體系。遺傳學(xué)途徑 表觀遺傳途徑 生化途徑 生物信息途徑（注：本設(shè)計(jì)為技術(shù)流程的主要途徑，相互之間有交織）作物抗病分子設(shè)計(jì)的理論與技術(shù)體系作物抗病資源,擬南芥突變體基因定位克隆與功能分析植物抗病機(jī)制與信號途徑抗病育種分子標(biāo)記與分子設(shè)計(jì)抗病等位基因和功能分化抗病 TGS 途徑, sRNA 表達(dá)譜miRNA,RdDM調(diào)控 R 基因RNA 沉默與水稻抗病性水稻 sRNA 靶標(biāo)與抗性途徑植物新抗病理論與技術(shù)體系蛋白互作,關(guān)鍵基因鑒定致病因子新靶標(biāo)與功能免疫調(diào)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)激素途徑和產(chǎn)量性狀抗病高產(chǎn)育種基礎(chǔ)理論重要數(shù)據(jù)庫分析與發(fā)掘腐生菌侵染與表達(dá)譜分析重要調(diào)控基因鑒定與分析蛋白互作的分子特征與預(yù)測重要免疫途徑基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要農(nóng)作物重大病害抗病機(jī)制為模式的植物免疫創(chuàng)新研究體系（三）創(chuàng)新性與特色植物免疫與作物抗病性研究是國際植物生物學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)領(lǐng)域，研究的問題復(fù)雜、涉及的學(xué)科范圍和技術(shù)方法廣、學(xué)科發(fā)展快、國際競爭大。目前我國在這方面的研究與技術(shù)體系與歐美等國家相比，還具有很大的的差距。但是，我國在作物應(yīng)用基礎(chǔ)研究以及相關(guān)領(lǐng)域人才隊(duì)伍建設(shè)方面具有明顯優(yōu)勢。本項(xiàng)目根據(jù)學(xué)科發(fā)展和本國農(nóng)作物病害的特點(diǎn)，立足于創(chuàng)新、突出研究重點(diǎn)、發(fā)揮自身優(yōu)勢，做出跨越式的發(fā)展并提升我國在本領(lǐng)域的研究水平和地位。本項(xiàng)目在以下方面具有創(chuàng)新性和特色：1. 新的總體研究思路。圍繞國際學(xué)科發(fā)展趨勢，以系統(tǒng)闡明植物包括重要糧食作物的免疫機(jī)理為目標(biāo)，結(jié)合我國轉(zhuǎn)基因新品種培育中抗病分子育種這一重大需求。以作物對重要活體寄生（biotroph ）與腐生（ necrotroph）病害的免疫應(yīng)答及其互作為主線，強(qiáng)調(diào)頂層設(shè)計(jì)與整合；建立以我國主糧作物重大病害抗病機(jī)制為模式的創(chuàng)新研究體系。2. 從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和學(xué)科發(fā)展中提煉關(guān)鍵科學(xué)問題，創(chuàng)建特色研究體系。本項(xiàng)目緊密結(jié)合學(xué)科創(chuàng)新和國家重大需求，以我國重要農(nóng)作物病害抗性為研究重點(diǎn)，借鑒以擬南芥為主要模式的研究方法與研究成果，提出了 4 個關(guān)鍵科學(xué)問題，重點(diǎn)研究作物廣譜持久抗性的分子基礎(chǔ)；植物抗病性的表觀遺傳學(xué)機(jī)制；抗病性與產(chǎn)量性狀的關(guān)系，及抗病育種分子設(shè)計(jì)新思路。為此，在相關(guān)領(lǐng)域設(shè)置了6 個相互交叉的研究課題，并把主要研究方向集中在水稻和麥類抗病分子機(jī)理，推動以水稻抗病性為主要模式體系的轉(zhuǎn)換，建立我國特色的植物免疫和作物抗病育種基礎(chǔ)理論的前沿領(lǐng)域。3. 新的前瞻性研究部署。國際上植物免疫的研究已經(jīng)進(jìn)入更高層次的研究領(lǐng)域。本項(xiàng)目密切結(jié)合學(xué)科發(fā)展動向，前瞻性地部署前沿研究領(lǐng)域，重點(diǎn)包括植物基礎(chǔ)免疫與?；悦庖叩慕换プ饔茫╟ross-talk） 、表觀遺傳機(jī)制對于植物免疫的調(diào)控功能和新的抗病性研究策略、作物廣譜持久抗病性的機(jī)制等。尤其是植物免疫的表觀遺傳機(jī)制是植物生物學(xué)的新興研究領(lǐng)域，存在若干重要的科學(xué)問題亟待闡明。國際上，包括 RdDM 途徑的表觀遺傳學(xué)研究主要集中在植物自身的開花發(fā)育調(diào)控和非生物脅迫應(yīng)答?？共?RNA 沉默 的研究也主要集中在擬南芥和煙草上。表觀遺傳機(jī)制應(yīng)答生物脅迫和作物的抗病沉默機(jī)制的研究的報導(dǎo)寥寥無幾。以植物免疫的表觀遺傳機(jī)制為主線，從模式植物到我國主要糧食作物，結(jié)合項(xiàng)目各課題組已建立起來、各具特色的實(shí)驗(yàn)體系和工作平臺，拓展表觀遺傳機(jī)制調(diào)控抗?。ú《?、細(xì)菌和真菌）應(yīng)答研究領(lǐng)域。本項(xiàng)目對植物免疫的表觀遺傳機(jī)制的創(chuàng)新研究，將為農(nóng)作物抗病從理論和應(yīng)用實(shí)踐上開辟新的研究體系。4. 利用和創(chuàng)制特色研究材料。為實(shí)現(xiàn)項(xiàng)目目標(biāo)，本項(xiàng)目將廣泛收集和創(chuàng)制新型的研究材料，如作物廣譜抗病和 QTL 遺傳資源、抗腐生病害遺傳資源、抗病基因抑制（suppressor ）突變體。并以已經(jīng)定位克隆的、有自主知識產(chǎn)權(quán)的一批重要廣譜抗病基因如 xa13、 Xa30， Pigm、 Pid-2、 ROD1、 OsNPR1、 等為研究的重要出發(fā)點(diǎn)，緊密結(jié)合作物遺傳育種，建立作物抗病分子設(shè)計(jì)的理論、應(yīng)用基礎(chǔ)和共性技術(shù)體系。5. 新的技術(shù)路線集成。本項(xiàng)目廣泛采用 組學(xué)和復(fù)雜性狀的研究方法，利用正向、反向遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)，并結(jié)合生物信息學(xué)、蛋白組學(xué)、現(xiàn)代生物化學(xué)等研究技術(shù)，系統(tǒng)剖析作物對重要病原菌的識別機(jī)制與應(yīng)答的信號網(wǎng)絡(luò)，并整合作物抗病性與產(chǎn)量性狀的互作途徑，創(chuàng)建抗病分子設(shè)計(jì)育種體系。尤其將開展水稻抗瘟性復(fù)等位基因的簇內(nèi)重組，創(chuàng)造新的廣譜抗病基因位點(diǎn)，在抗病遺傳理論與育種實(shí)踐上都是一個有重大創(chuàng)新意義的課題。6. 新的目標(biāo)視野。本項(xiàng)目除了要在植物免疫學(xué)科領(lǐng)域上創(chuàng)立我國的高水平前沿研究優(yōu)勢，取得系統(tǒng)性的研究成果，同時也要在作物廣譜持久抗性尤其是數(shù)量性狀（QTL ）抗性的分子機(jī)制、腐生菌（如紋枯?。┑目共』蛸Y源、作物抗病育種的分子設(shè)計(jì)理論與實(shí)踐等方面建立國際領(lǐng)先的研究體系與技術(shù)平臺。創(chuàng)新性研究成果（如水稻廣譜抗病性基因）的應(yīng)用有可能為農(nóng)作物抵抗類似于水稻紋枯病這樣的疑難病害做出重大貢獻(xiàn)。從而為推動抗病新策略、新技術(shù)的發(fā)展提供直接的指導(dǎo)。7. 新的研究隊(duì)伍建設(shè)。依托本項(xiàng)目的實(shí)施，將進(jìn)一步凝練我國在植物免疫和作物抗病分子領(lǐng)域的戰(zhàn)略目標(biāo)，培養(yǎng)一批在專業(yè)領(lǐng)域具有高國際顯示度的中青年學(xué)科帶頭人，建設(shè)具有國際一流水平的創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)。（四）取得重大突破的可行性分析在植物免疫和作物抗病性研究領(lǐng)域，雖然要全面超越國際一流研究水平還要進(jìn)行長期、艱苦的研究與探索，但是本項(xiàng)目的實(shí)施也存在諸多有利因素，其中包括研究資源、研究基礎(chǔ)、人才隊(duì)伍和儀器裝備等幾方面的有利條件，本項(xiàng)目具備圓滿完成預(yù)定計(jì)劃的能力和工作條件。1. 項(xiàng)目有廣泛共識：本項(xiàng)目已經(jīng)經(jīng)過 3 年多的籌備，尤其通過 2009 年 5月第 349 次香山科學(xué)會議植物先天免疫機(jī)制 、2010 年 2 月第 9 次中國科學(xué)院上海交叉學(xué)科論壇植物免疫與作物生產(chǎn) ，與會專家與項(xiàng)目組骨干進(jìn)行了廣泛的討論，根據(jù)學(xué)科的發(fā)展與國家農(nóng)業(yè)的重大需求，凝練了關(guān)鍵的科學(xué)問題與重點(diǎn)研究方向，研究思路明確，目標(biāo)集成可行性強(qiáng)。2. 具有豐富的研究資源。我國主要農(nóng)作物栽培歷史長，栽培區(qū)域差異大，抗病性資源豐富，并具有較高的抗病育種水平。這為本項(xiàng)目通過功能基因?qū)W的方法，研究不同農(nóng)作物品種抗病分子機(jī)理，在以水稻為主的重要農(nóng)作物的抗病分子機(jī)理研究，可以做出創(chuàng)新性和有特色的研究成果。3. 技術(shù)路線成熟。近年來植物分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展，擬南芥及水稻基因組已相繼完成測序，小麥基因組 454 高通量序列的豐富，基因定位克隆已經(jīng)實(shí)現(xiàn)日常化。其它相關(guān)的平臺, 如表觀遺傳、蛋白組學(xué)、表達(dá)組學(xué)、生物信息學(xué)、植物病理學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞生物學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究手段均已建立并不斷改進(jìn)。這些成熟的技術(shù)平臺為順利開展本項(xiàng)目并完成目標(biāo)提供了可靠的保障。4. 研究基礎(chǔ)較好。通過承擔(dān)國家 863 計(jì)劃、國家基金重大研究計(jì)劃和重點(diǎn)項(xiàng)目、國家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大項(xiàng)目等多項(xiàng)研究的積累，本項(xiàng)目組各個課題已經(jīng)在科學(xué)研究思路、實(shí)驗(yàn)材料、研究實(shí)驗(yàn)體系、數(shù)據(jù)分析能力、國際學(xué)術(shù)交流等方面打下了較好的研究基礎(chǔ)。一些前期研究已經(jīng)處于穩(wěn)步開展階段，多個作物主要抗病基因和擬南芥免疫關(guān)鍵調(diào)控基因已經(jīng)克隆，植物表觀遺傳機(jī)制已有重大新發(fā)現(xiàn)，為本項(xiàng)目的順利實(shí)施提供了有力保障。項(xiàng)目的實(shí)施將依托 7 個國家和 3 個部門重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（詳見工作條件部分） ，具有先進(jìn)的儀器設(shè)備和國內(nèi)一流的工作條件。在植物免疫途徑（PTI，ETI）及其互作、植物免疫的表觀遺傳調(diào)控、SAR 調(diào)控、作物廣譜抗病基因的功能機(jī)制及其育種應(yīng)用、水稻抗紋枯病等方面可望有重大的突破性成果。5. 研究隊(duì)伍具備國際競爭力。本項(xiàng)目組織的骨干隊(duì)伍集中了國內(nèi)優(yōu)勢的研究單位，研究方向全面、合理，分別涉及到農(nóng)作物抗病、真菌病害、細(xì)菌病害、病毒病害等本領(lǐng)域重點(diǎn)分支，在多個研究領(lǐng)域如水稻功能基因組學(xué)、植物免疫、作物抗病性、病原菌基因組學(xué)、表觀遺傳等方面做出了一系列突破性的研究成果， 。在過去數(shù)年間，本項(xiàng)目骨干作為第一或通訊作者的多篇研究論文發(fā)表于國際重要學(xué)術(shù)期刊如 Cell 及其系列, Nature 系列, Science, Plant Cell, PNAS, Genome Research, EMBO J, Cell Host & Microbes, PLoS Pathogens， Journal of Virology, Plant Journal, Plant Physiology, Molecular Microbe-Plant Interaction 等。具備進(jìn)行創(chuàng)新研究的團(tuán)隊(duì)基礎(chǔ)和較強(qiáng)的國際競爭實(shí)力。此外，項(xiàng)目組大部分骨干都曾在國際上著名的實(shí)驗(yàn)室中從事植物分子生物學(xué)和植物病理學(xué)工作多年，在國內(nèi)建立了優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)室，并和國際權(quán)威人士建立了良好的交流與合作關(guān)系。這些條件均對本項(xiàng)目的開展是一個有力的支持。四、年度計(jì)劃研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第一年1. 擬南芥 PTI 相關(guān)突變體的篩選；PRR受體蛋白酵母雙雜交庫的構(gòu)建；抗病蛋白系列置換突變體構(gòu)建與功能分析；水稻抗病蛋白與病原菌效應(yīng)蛋白基因的克隆。2. Xoo 鞭毛蛋白基因/解毒蛋白基因及突變體的克??；構(gòu)建 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白等 PAMPs 編碼基因的缺失突變體；構(gòu)建多個水稻基因變量表達(dá)的雙元載體；效應(yīng)蛋白基因轉(zhuǎn)基因；建立純化EPS 天然寡聚體的技術(shù)平臺以及 EPS寡聚體生物活性檢測系統(tǒng)。3. 對 bir1,snc1,snc2,snc4，mkk1 mkk2這 5 個組成型抗病的突變體做抑制子篩選；對抑制子進(jìn)行表型分析及初定位；建立 SAR 篩選體系，分析SARD1 及 SARD2 的生化功能；擬南芥 MEKK1 結(jié)合蛋白酵母雙雜交篩選。4. 利用 -ray 輻射誘變和 EMS 化學(xué)誘變抗病品種 GM4(Pigm)，篩選 Pigm基因的抑制因子 spi（suppressors of Pigm） ；利用體內(nèi)和體外方法篩選水稻 EMS 誘變 F2 群體，獲得對 Xoo LPS 敏感性發(fā)生改變的突變材料，創(chuàng)建該突變材料的分離群體并開始進(jìn)行圖位克??；。建立分離 LPS 結(jié)合蛋白的生物化學(xué)標(biāo)記體系。5. 采用激光顯微切割，結(jié)合禾谷鐮孢活體熒光標(biāo)記、基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；研究宿主作物-禾谷鐮孢互作細(xì)胞學(xué)過程；病毒侵染擬南芥，microarray 高通量表觀遺傳途徑相關(guān)蛋白基因表達(dá)檢測；抗病 TGS蛋白目標(biāo)基因篩選、及其表達(dá)譜檢測。6. 建立病毒侵染水稻的研究體系，構(gòu)建1. 分離鑒定 PTI 途徑基因 1-2 個；分離鑒定 ETI 途徑基因 1-2 個；克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 1-2 個；得到與MEKK1 結(jié)合的候選蛋白；鑒定抗病蛋白下游組份 1-2 個；明確植物抗病蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。2. 明確兩種 Xoo/Xoc PAMPs 突變體對水稻致病性的變化；明確 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白和另外一種 PAMPs 誘導(dǎo)水稻的防御反應(yīng)的能力；構(gòu)建 3-5 個水稻轉(zhuǎn)基因載體。3. 篩選到 5 個組成型抗病突變體的相關(guān)抑制子；建立 SAR 篩選體系；完成對 SARD1 及 SARD2 的生化功能分析；篩到多個 spi 感病突變單株。4. 得到宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；利用基因組方法分析 RDV 病毒感染后水稻基因組的變化。5. 明確擬南芥中參與抗病的表觀遺傳途徑相關(guān)蛋白；明確 Xoo 誘導(dǎo)或抑制水稻表達(dá)的特異小 RNA 和 mRNA；獲得針對RDR2， DCL3， DCL1，DCL4，AGO1和 AGO4 等的 RNAi 突變體株系。6. 篩選并獲得水稻 LPS 非敏感型突變體；建立篩選 LPS 結(jié)合蛋白的生化體系并開展篩選工作。7. 分析乙烯對水稻抗抗病性的作用，構(gòu)建相應(yīng)的水稻研究株系。8. 構(gòu)建水稻 OsNPR1 基因的遺傳學(xué)研究株系并進(jìn)行表型鑒定；獲得水稻抗ROD 基因轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料；定位克隆 2 個以上水稻抗白葉枯病基因或 QTL；發(fā)表關(guān)于 Pigm 基因功能的相關(guān)論文。9. 精細(xì)定位抗銹病 QTL；克隆 2 個抗黃萎病相關(guān)基因。10. 獲得小麥 EDR1 和 EDR2 基因各 1研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)針對水稻 RNA 干擾途徑主要基因的轉(zhuǎn)基因 RNAi 突變體株系，包括RDR1,RDR6,AGOs,PolIV,PolV,DCL2 等；利用酵母雙雜交方法，篩選受 RDV病毒侵染前后水稻基因表達(dá)譜的變化并對其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。7. Xoo 誘導(dǎo)水稻小 RNA 的 Solexa 測序建立 miRNA 與 siRNA 表達(dá)譜。RNA-seq 測序，建立 mRNA 表達(dá)譜。 8. 獲得乙烯耐受水稻株系，對多種致病稻瘟病菌進(jìn)行感病分析；利用 MCP處理，分析抗性水稻在喪失乙烯反應(yīng)后對相應(yīng)的稻瘟病菌發(fā)生的抗性變化；將乙烯耐受基因?qū)肟剐缘乃酒贩N；將造成組成性乙烯反應(yīng)將有轉(zhuǎn)入感病水稻品種以及抗病水稻品種中，獲得相關(guān)的組成性乙烯反應(yīng)水稻材料；分析過表達(dá) OsNPR1 基因不同株系的抗病性及其它與生長發(fā)育有關(guān)的表型。9. 完成對 Pigm 基因的功能鑒定工作；水稻抗 ROD 基因的克?。凰究拱兹~枯病基因或 QTL 的定位；小麥抗銹病 QTL 的定位工作；抗黃萎病相關(guān)基因的定位工作；新型等位基因的克?。嚎寺∷?PID3 基因以及小麥Yr10、Yr18 和 Yr36 的新型等位基因；小麥 EDR1 和 EDR2 基因的獲得；10. 構(gòu)建 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合載體和 Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體（自然表達(dá)，即使用自身啟動子） ；開展廣譜抗病品種的轉(zhuǎn)基因及分子育種工作，水稻抗病基因的分子標(biāo)記聚合育種：利用基因標(biāo)記，將水稻xa5、Xa21 、Pid2 和 Pid3 基因轉(zhuǎn)育我國超級雜交稻的恢復(fù)系親本 93-11和明恢系列的品種；水稻 Pigm 與Pi9 基因重組位點(diǎn)的創(chuàng)建；小麥抗條銹病基因的分子標(biāo)記聚合育種： 利用基因標(biāo)記，將小麥 Yr10、Yr18 和Yr36 基因轉(zhuǎn)育我國小麥主產(chǎn)區(qū)品種“濟(jì)麥 19”和“鄭麥 9023”。個；克隆水稻 PID3 和小麥Yr10、 Yr18 和 Yr36 新型等位基因3-5 個。11. 獲得一批廣譜抗病轉(zhuǎn)基因或分子育種品系；獲得 1000 份攜帶水稻 PID3 或小麥 Yr10、Yr18、Yr36 等基因的材料。12. 構(gòu)建 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合載體和 Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體各 1 個。13. 獲得有 10 萬個體的 F2 群體，篩選獲得鑒定 Pigm 和 Pi9 基因的菌株2-3 個，特異鑒別這兩個基因的 PCR分子標(biāo)記 2-3 個。14. 發(fā)表 SCI 文章 10 篇左右。15. 申請專利 5-6 個。研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第二年1. PTI 通路新基因的克隆、鑒定；PRR受體蛋白互作蛋白篩選。2. Xoo 鞭毛蛋白/解毒蛋白的分離純化及生化分析；效應(yīng)蛋白對宿主信號通路的作用分析；抗病蛋白不同結(jié)構(gòu)域間互作分析，及這種互作與蛋白功能和下游信號通路之間的關(guān)系分型；構(gòu)建大麥表皮細(xì)胞富集百分病菌轉(zhuǎn)錄本的酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建。3. 利用圖位克隆和高通量測序技術(shù)鑒定bir1, snc1, snc2, snc4，mkk1 mkk2 的抑制子所在的突變位點(diǎn)；對 SAR 突變體進(jìn)行表型分型及初定位；進(jìn)行MEKK1 免疫共沉淀。4. 鑒定 BBI1（E3 ligase） ，OsRAR1,OsNPR1,OsSGT1 的感病純合突變單株,分別與含有 Pigm 轉(zhuǎn)基因日本晴株系雜交。5. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；分析其免疫應(yīng)答與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點(diǎn)/關(guān)鍵分子；通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選活性 EPS 寡聚體誘導(dǎo)表達(dá)的宿主植物基因。6. 進(jìn)行抗病 TGS 目標(biāo)蛋白作用關(guān)鍵靶基因篩選、及其 DNA 的作用模式分析、同時進(jìn)行病毒侵染關(guān)鍵靶基因表達(dá)譜改變分析；探索病毒侵染對水稻包括 miRNA 在內(nèi)的內(nèi)源 RNAs 表達(dá)的影響。7. 利用生物信息學(xué)方法對 Xoo 侵染水稻獲得的小 RNA 進(jìn)行分類，預(yù)測小RNA 的靶基因；mRNA 表達(dá)譜分析。8. 鑒定及獲得帶有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻斷乙烯反應(yīng)后對稻瘟病菌的抗病變化。鑒定及獲得組成性乙烯反應(yīng)的水稻材料株系；分析在組成性乙烯發(fā)育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻對病原菌侵染的反應(yīng)及病斑程度。利用microarray 等技術(shù)，分析 OsNPR1 基1. 再分離鑒定 PTI 途徑基因 1-2 個及ETI 途徑基因 1-2 個，并明確這些基因的功能。再克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 1-2 個，并認(rèn)識病原效應(yīng)蛋白基因的功能，分離其植物體內(nèi)的靶標(biāo)基因3-5 個；鑒定抗病蛋白復(fù)合體組份 2-3 個，明確植物 NB-LRR 類抗病蛋白分子間的相互作用及對其功能的影響；找到 bir1, snc1, snc2, snc4，mkk1 mkk2 的抑制子基因 3-4 個。2. 明確水稻 OsFLS2 對鞭毛蛋白的感知能力；獲得涉及 2 個基因的變量表達(dá)的突變體株系；構(gòu)建獲得 2 個水稻病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的 cDNA 文庫。3. 初步定位 1-2 個 SAR 突變體；解析MEKK1 結(jié)合蛋白；初步建立鑒定Pigm 的抗病防衛(wèi)反應(yīng)基礎(chǔ)信號網(wǎng)絡(luò)體系。4. 得到宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；揭示其與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點(diǎn)/關(guān)鍵分子。5. 明確病毒-參與抗性 TGS 目標(biāo)蛋白-靶基因 DNA 甲基化的作用三者互作關(guān)系和調(diào)控模式；得到一整套針對水稻RNA 干擾途徑主要基因的穩(wěn)定的RNAi 突變體株系。6. 對 LPS 受體基因進(jìn)行遺傳和物理定位；構(gòu)建候選 LPS 結(jié)合蛋白的水稻遺傳學(xué)研究株系。7. 分析乙烯反應(yīng)被阻斷后對水稻抗病性的影響及相關(guān)表型變化。8. 鑒定與 RDV P2 蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的生化功能。9. 篩選并獲得水稻 OsNPR1 基因調(diào)控的信號途徑下游成分并對其進(jìn)行遺傳分析。10. 完成 ROD 基因功能鑒定工作；完成水稻抗白葉枯病基因（QTL）的功能鑒定；獲得 Pigm/ROD 的 supprosser的穩(wěn)定突變；定位克隆一個抗銹病QTL；11. 分別獲得 4-10 個 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或 Yr10-Yr18-Yr36 陽性的轉(zhuǎn)基因株研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)因介導(dǎo)的 SAR 與生長素信號途徑等之間具有 cross-talk 功能的候選基因。9. ROD 基因功能的鑒定工作；水稻抗白葉枯病基因（QTL）的功能鑒定工作；新廣譜抗病基因（QTL）的定位工作；抗銹病 QTL 的定位工作；研究抗黃萎病相關(guān)基因。對上年度獲得的新型抗病等位基因（PID3、 Yr10、Yr18 和 Yr36 等） ，構(gòu)建自然表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻或小麥中；小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因的功能驗(yàn)證。10. 分別將 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合載體和 Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體導(dǎo)入水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列。11. 通過突變、剪切或重組，創(chuàng)建PID3、Yr10、Yr18 或 Yr36 基因的新型設(shè)計(jì)抗病基因；水稻 Pigm 與Pi9 基因重組位點(diǎn)的創(chuàng)建；繼續(xù)水稻xa5、Xa21 、Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育；利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥Yr10、Yr18 和 Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。系 4-10 個 。12. 創(chuàng)建 PID3、Yr10 、Yr18 或 Yr36 基因的新型設(shè)計(jì)抗病基因 2-5 個。13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 2-3 株。14. 發(fā)表 SCI 文章 10-12 篇。15. 申請專利 7-8 個。第三年1. PTI 通路新基因的生化和分子生物學(xué)分析；PRR 受體蛋白互作蛋白的功能鑒定。2. Xoo 鞭毛蛋白/解毒蛋白的糖基化分析及表型分析；效應(yīng)蛋白靶蛋白的分離鑒定；抗病蛋白互作蛋白的篩選；抗病基因和無毒基因互作的分子機(jī)制研究。3. 對 bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2這 5 個突變體做進(jìn)一步的抑制子篩選，克隆更多的基因；利用圖位克隆和全基因組測序技術(shù)篩選到 SAR 突變體的突變位點(diǎn)；MEKK1 結(jié)合蛋白及 FLS2 介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能驗(yàn)證; 水稻 MAPK 突變體，RNAi 植株純合及抗病分析。4. 利用圖位克隆的方法鑒定 spi 基因。1. 認(rèn)識 PTI 途徑相關(guān)基因編碼蛋白的生化和分子生物學(xué)特性；明確 ETI 途徑相關(guān)基因編碼的抗病蛋白的生理生化特性；明確病原菌效應(yīng)蛋白靶標(biāo)基因的功能及分子特性。2. 克隆 1-2 個新的 bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。3. 明確 1-2 個 RLKs、 WRKYs 或 ERFs 在水稻抗病性中的作用；篩選獲得一批與 RLK、WRKY 或 ERF 互作的候選蛋白；初步確定 PTI 中受調(diào)控的基因。4. 確定 1-2 個 SAR 突變體的突變位點(diǎn)；解析連接 MEKK1 與 PRR 受體 FLS2 的蛋白組份。5. 克隆到 1 個 Pigm 的抑制子 spi。6. 明確 3-5 個在宿主作物-禾谷鐮孢互作中起作用的重要基因；初步揭示活研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)分析 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體在病原識別和植株發(fā)育過程中的功能。5. 綜合運(yùn)用各種生物手段具體研究禾谷鐮孢應(yīng)答基因在植病互作中起重要作用；用不同的 EPS 寡聚體處理宿主植物，接種病源菌，觀察其侵染能力的變化。6. 構(gòu)建關(guān)鍵靶基因過表達(dá)和敲除突變體，并進(jìn)行病毒侵染性的分析；研究水稻RNA 干擾途徑對病毒侵染的抵抗作用；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小 RNA 與潛在靶標(biāo)的調(diào)控關(guān)系；在水稻 dcl4 突變體中受Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 的表達(dá)是否依賴 dcl4 基因。7. 利用 RNAi 和過表達(dá)方法對 SA 與生長素途徑之間具有重要作用的基因進(jìn)行分析，闡明其遺傳學(xué)功能。8. 繼續(xù) ROD 基因研究工作；水稻抗白葉枯病基因（QTL）的功能鑒定，克隆 2 個新的廣譜抗病基因（QTL） ；Pigm/ROD 的 supprosser 突變基因的定位工作；新的抗銹病 QTL 的定位；繼續(xù)克隆抗黃萎病相關(guān)基因。利用攜帶新型等位基因（PID3、Yr10 、Yr18 和 Yr36 等）的轉(zhuǎn)基因植株，確定轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式；小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗(yàn)證。9. 評價 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 聚合載體對水稻白葉枯病和稻瘟病的抗性特征；評價 Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體對小麥條銹病的抗性特征。利用突變、剪切或重組等手段獲得的新型PID3、Yr10、Yr18 或 Yr36 基因，構(gòu)建各自的自然表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列；水稻 Pigm9 新位點(diǎn)的功能評價。10. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)水稻xa5、Xa21 、Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育。11. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥Yr10、Yr18 和 Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。性 EPS 寡聚體對宿主植物抵抗病源菌入侵的作用；明確靶基因?qū)Σ《厩秩镜膽?yīng)答效應(yīng)，及其參與的抗性途徑機(jī)制和調(diào)控作用。7. 找出參與抗病毒的水稻關(guān)鍵的 RNA干擾途徑的主要組份；明確候選小RNA 的靶標(biāo)基因，及 Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 是否依賴 RNA 沉默途徑。8. 分析候選水稻 LPS 受體及結(jié)合蛋白的功能及在病原識別和發(fā)育調(diào)控中的分子功能。9. 對乙烯途徑與水稻抗稻瘟病反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能分析。10. 研究 P2 蛋白影響 GA 合成途徑的關(guān)鍵因子及影響機(jī)制。11. 分析 OsNPR1 介導(dǎo)的 SA 與生長素途徑之間的 crosstalk 及關(guān)鍵因子功能；發(fā)表關(guān)于 ROD 基因研究工作的論文；發(fā)表水稻抗白葉枯病基因（QTL ）功能相關(guān)的論文；克隆 2 個新的廣譜抗病基因（QTL） ；克隆至少一個Pigm/ROD 的 supprosser 突變基因；克隆一個新的抗銹病 QTL。12. 確定 EDR1 和 EDR2 轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式；獲得具有新型抗性特征的基因 1-2 個；確定多基因聚合載體在受體基因組的整合和表達(dá)模式； 確定多基因聚合載體賦予受體植株的抗病特征。13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 2-3 株；獲得Pigm9 位點(diǎn)純合的單株 2-3 個。14. 發(fā)表 SCI 收錄論文 18-24 篇。15. 申請專利 10-12 項(xiàng)。研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)第四年1. PTI 通路新基因在植物抗病途徑信號傳導(dǎo)途徑中作用及位置分析；PRR受體蛋白互作蛋白下游信號通路研究。2. Xoo 鞭毛蛋白/解毒蛋白作用及機(jī)制分析；效應(yīng)蛋白靶蛋白的功能分析；抗病蛋白互作蛋白的功能鑒定及分子生物學(xué)研究；抗病基因和無毒基因互作的分子機(jī)制研究。3. 熒光互補(bǔ)與免疫共沉淀研究 PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中至少 2 個蛋白間的相互作用；構(gòu)建從酵母雙雜交或免疫沉淀篩選到PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中的重要組分的過量表達(dá)與 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株，人工接種鑒定其抗病性。4. 利用酵母雙雜及免疫共沉淀技術(shù)，尋找其他參與 R 蛋白下游傳導(dǎo)的蛋白及其他參與 SAR 下游傳導(dǎo)的蛋白；深入解析 MEKK1 結(jié)合蛋白、FLS2 介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能。水稻 MAPK上下游蛋白元件分析。5. 從蛋白生化反面分析 Pigm 與OsSGT1，BBI1，OsRAR1，OsNPR1 是否存在互作，結(jié)合遺傳的數(shù)據(jù)，建立Pigm 的基礎(chǔ)抗病防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。6. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在活體/半活體病原侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；通過分離、純化獲得活性寡聚體；應(yīng)用分離到的1. 明確 PTI 途徑相關(guān)基因在植物 PTI 信號傳導(dǎo)途徑中的位置及作用；明確ETI 途徑相關(guān)基因編碼的抗病蛋白的下游靶標(biāo)基因，確定其在 ETI 信號傳導(dǎo)途徑中的作用；確定病原菌效應(yīng)蛋白靶標(biāo)基因的識別機(jī)制及其激活下游信號傳導(dǎo)的途徑及機(jī)制；確定植物抗病蛋白抗病復(fù)合的組分，明確植物抗病蛋白的作用機(jī)制及信號傳導(dǎo)機(jī)制；確定 R 蛋白下游傳導(dǎo)的蛋白與已知蛋白的關(guān)系；明確水稻 PTI 途徑中至少 2 個關(guān)鍵組分間的互作關(guān)系；明確至少一個 PTI 中關(guān)鍵組分在植物免疫中的功能。2. 找到 SAR 信號通路相關(guān)分子；確定新蛋白與已知蛋白的關(guān)系；闡明一個完整的參與抗病的 MAPK 蛋白激酶級聯(lián)。3. 篩選驗(yàn)證 Pigm 互作蛋白。4. 得到宿主作物細(xì)胞在活體/ 半活體病原侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；建立體外酶促產(chǎn)生苜蓿根瘤菌 EPS 胞外寡聚體的技術(shù)方法。5. 明確病毒侵染改變靶基因 siRNA 和DNA 甲基化是病毒干擾表觀遺傳途徑的作用結(jié)果。6. 獲得具有潛在育種前景的水稻材料或株系 2-3 個。7. 闡明 LPS 受體及結(jié)合蛋白作用的功能機(jī)制，建立病原識別及生長發(fā)育調(diào)研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)活性 EPS 寡聚體處理擬南芥，接種丁香假單胞菌。7. 進(jìn)行病毒侵染前后靶基因相關(guān) siRNA northern blot、測序檢測；靶基因DNA 甲基化測序、Southern blot 檢測和信息學(xué)分析；和上述在目標(biāo)突變體的研究結(jié)果相比較，研究突變體和病毒侵染對靶基因甲基化改變的相關(guān)性；根據(jù)第 1-3 年的研究結(jié)果進(jìn)一步研究RNA 干擾的作用機(jī)理及其在抗病毒中的作用；利用過表達(dá)人工 miRNA 等轉(zhuǎn)基因方法對 2-3 個水稻小 RNA 介導(dǎo)的抗病反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。8. 闡明 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其與細(xì)菌表面分子相互作用的功能機(jī)制，建立病原信號識別與發(fā)育之間的聯(lián)系途徑；鑒定及獲得上述轉(zhuǎn)基因水稻株系，分析其對病原菌抗病或是感病的變化，對上述水稻材料分別進(jìn)行乙烯和 MCP 處理，揭示在該相關(guān)基因表達(dá)背景下，乙烯與MCP 的作用對于感病過程是否依然重要。9. 闡明病毒侵染與植物 GA 信號途徑之間的分子互作關(guān)系。10. 利用轉(zhuǎn)基因手段對抗病及激素 cross-talk 通路進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，培育既增強(qiáng)抗性，又不影響生長發(fā)育的水稻株系；完成 2 個水稻抗白葉枯病基因（QTL）的工作；新廣譜抗病基因（QTL）的功能鑒定工作；Pigm/ROD的 supprosser 突變的功能鑒定工作；完成抗銹病 QTL 研究；抗黃萎病相關(guān)基因的研究。11. 在課題執(zhí)行過程中發(fā)掘或創(chuàng)建的新型抗病基因，包括等位基因（PID3、Yr10 、Yr18 和 Yr36 等） 、同源基因（EDR1 和 EDR2） 、和新型抗病位點(diǎn)（Pigm9）等，開展有關(guān)基因之間的聚合轉(zhuǎn)化和分子標(biāo)記聚合育種，結(jié)合抗病評價，獲得高抗水稻稻瘟病、小麥條銹病或小麥白粉病的株系；水稻 Pigm9 新位點(diǎn)的功能評控之間的功能聯(lián)系。8. 進(jìn)一步闡明乙烯在水稻抗稻瘟病中的功能及與產(chǎn)量性狀之間的關(guān)系。9. 闡明病毒侵染與植物 GA 信號途徑之間的分子互作關(guān)系；對水稻 SA 途徑及生長素途徑之間發(fā)揮重要作用的信號基因及蛋白進(jìn)行功能機(jī)制分析；發(fā)表水稻抗白葉枯病基因（QTL）的相關(guān)論文；完成新廣譜抗病基因（QTL）的功能鑒定；完成Pigm/ROD 的 suppross er 突變的功能鑒定；發(fā)表抗銹病 QTL 研究的相關(guān)論文。10. 設(shè)計(jì)另外兩套多基因聚合轉(zhuǎn)化或分子標(biāo)記聚合育種的模式；獲得高抗水稻稻瘟病、小麥條銹病或小麥白粉病的株系 5-10 個；獲得新的 Pigm9 抗病位點(diǎn) 2-3 個；用以改良感病高產(chǎn)水稻品種 10 個。11. 確定多基因轉(zhuǎn)化的聚合表達(dá)對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響；確定新型設(shè)計(jì)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式；獲得具有新型抗性特征的設(shè)計(jì)基因 1-3 個。12. 獲得同時攜帶 xa5、Xa21、Pid2 和Pid3 基因的水稻雜合種子。13. 獲得同時攜帶 Yr10、Yr18 和 Yr36 基因的小麥雜合種子。14. 發(fā)表 SCI 收錄論文 20-24 篇。15. 申請專利 8-10 項(xiàng)。研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)價及應(yīng)用。 12. 利用攜帶 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體并呈現(xiàn)新型抗病特征的轉(zhuǎn)基因植株，綜合評價多基因的聚合表達(dá)對受體產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響。13. 利用攜帶新型設(shè)計(jì)基因（PID3、 YR10、 YR18 或 YR36）的轉(zhuǎn)基因植株， 確定轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式，開展對水稻抗病病或小麥抗病評價。14. 利用基因標(biāo)記，開展水稻回交轉(zhuǎn)育過程的四親本雙交（具有相同回交親本的個體之間） ，獲得同時攜帶xa5、Xa21、Pid2 和 Pid3 基因的雜合種子。15. 開展小麥回交轉(zhuǎn)育過程的三親本雙交（具有相同回交親本的個體之間） ，獲得同時攜帶 Yr10、Yr18 和 Yr36 基因的雜合種子。第五年1. 構(gòu)建植物 PTI 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；明確 PRR受體蛋白及互作蛋白的信號傳導(dǎo)途徑。2. 明確 Xoo 鞭毛蛋白/解毒蛋白的作用機(jī)理；明確抗病蛋白識別效應(yīng)蛋白并激活下游信號傳導(dǎo)通路的機(jī)制；明確抗病蛋白抗病復(fù)合體的作用機(jī)制及下游信號傳導(dǎo)機(jī)制；解析抗病基因和無毒基因互作的分子機(jī)制。3. 利用遺傳學(xué)分析把篩選到的基因和已知基因做上下位分析，把基因放在信號通路的特定結(jié)點(diǎn)上。初步建立 R蛋白介導(dǎo)的病原菌免疫反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)。鑒定至少 1 個轉(zhuǎn)錄因子的順式元件，驗(yàn)證功能；定點(diǎn)突變與區(qū)域置換研究受體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；評價所研究的基因資源在植物抗病育種中的應(yīng)用價值。4. 通過生物化學(xué)手段闡明 SAR 過程中重要組分的生化功能；研究 FLS2 下游的信號傳遞元件在其它不同 PAMP識別中的作用。水稻 MAPK 上下游蛋白元件分析。5. 構(gòu)建 spi 的超表達(dá)，分析其抗病功能。6. 腐生病原菌同活體寄生病原菌的免疫1. 建立植物 PTI 信號傳導(dǎo)通路；建立作物 ETI 模式系統(tǒng)；明確植物 PTI 與ETI 途徑間的交互作用。2. 確定篩選到的抑制子的通路定位；鑒定一個轉(zhuǎn)錄因子的順式元件；初步了解受體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)；確定以上所研究基因在育種中的應(yīng)用價值；確定 SAR 過程中重要組分的生化功能；建立 spi 調(diào)控 Pigm 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型。3. 提出綜合改善植物抗病性的新思路和方法。4. 在新的層面明確病毒和寄主互作機(jī)制；和表觀遺傳調(diào)控途徑的抗病新機(jī)制；期望獲得抗 12 個流行水稻病毒的轉(zhuǎn)基因株系；明確水稻 RNA 沉默參與抗細(xì)菌的新功能。5. 建立水稻抗病性與激素調(diào)控途徑之間相互關(guān)系的基本理論框架。6. 創(chuàng)制高抗水稻白葉枯病、稻瘟病或小麥條銹病，產(chǎn)量和品質(zhì)性狀優(yōu)良的新種質(zhì) 5-10 份。7. 獲得 Pigm9 改良的水稻高抗高產(chǎn)優(yōu)良品系 23 個。8. 明確多基因聚合轉(zhuǎn)化對抗病、產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響；創(chuàng)制高抗高產(chǎn)優(yōu)研究內(nèi)容 預(yù) 期目標(biāo)反應(yīng)比較，鑒定共同的節(jié)點(diǎn)基因。7. 通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選活性 EPS 寡聚體誘導(dǎo)表達(dá)的擬南芥基因。8. 提出病毒干擾植物表觀遺傳途徑的作用機(jī)理，和作用模式，及水稻參與抗病表觀遺傳機(jī)制；探討 Xoo 參與水稻 RNA 沉默的分子機(jī)制。9. 繼續(xù)完成有關(guān)廣譜抗病基因的工作；重點(diǎn)于廣譜抗病品種的育種應(yīng)用；繼續(xù)開展有關(guān)抗病基因之間的聚合轉(zhuǎn)化和分子標(biāo)記聚合育種，結(jié)合抗病評價，獲得高抗稻瘟病、小麥條銹病等病害的株系，同時考察高抗聚合株系產(chǎn)量和品質(zhì)等重要性狀；水稻 Pigm9 新位點(diǎn)的應(yīng)用：考查 Pigm9 改良株系新品系的田間性狀。10. 對于攜帶 xa5-Xa21-Pid2-Pid3 或 Yr10-Yr18-Yr36 聚合載體的轉(zhuǎn)基因水稻或小麥，繼續(xù)評價多基因的聚合表達(dá)對植株抗病、產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響；創(chuàng)制高抗高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻和小麥新種質(zhì)。11. 獲得在相同回交親本背景下攜帶純合xa5、Xa21 、Pid2 和 Pid3 基因的水稻株系，開展抗病特征分析以及對產(chǎn)量和品質(zhì)等重要性狀的評價；并用以創(chuàng)制高抗水稻白葉枯病和稻瘟病的新種質(zhì)。12. 獲得在相同回交親本背景下攜帶純合Yr10、Yr18 和 Yr36 基因的小麥株系，開展抗病特征分析以及對產(chǎn)量和品質(zhì)等重要性狀的評價；并用以創(chuàng)制高抗小麥條銹病的新種質(zhì)。13. 根據(jù)情況整理上述工作結(jié)果，完成補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備論文發(fā)表和課題結(jié)題報告。質(zhì)的水稻和小麥新種質(zhì) 10-15 份。9. 闡明 xa5、 Xa21、Pid2 和 Pid3 基因雜交聚合賦予受體水稻的抗病特征及其對產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響；創(chuàng)制高抗水稻白葉枯病和稻瘟病的新種質(zhì)10-15 份；闡明 Yr10、Yr18 和 Yr36 基因雜交聚合賦予受體小麥的抗病特征及其對產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀的影響；創(chuàng)制高抗小麥條銹病的新種質(zhì) 10-15份；初步建成水稻和小麥抗病分子設(shè)計(jì)模式體系。10. 發(fā)表 SCI 文章 24-26 篇。11. 申請專利 6-8 個，授權(quán) 2-3 個。12. 獲省部級科研成果 1-2 項(xiàng)。13. 完成項(xiàng)目結(jié)題報告。一、研究內(nèi)容本項(xiàng)目包括以下 6 個主要研究內(nèi)容：（1）植物對病原菌的識別機(jī)制和新模式的建立；（2) 植物免疫的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；（ 3）植物免疫的表觀遺傳（epigentics）調(diào)控與新體系的建立；（4) 植物免疫激素途徑和抗病性與作物產(chǎn)量性狀的關(guān)系；（5）作物廣譜和持久抗性的遺傳與分子基礎(chǔ)；（6）作物抗病分子設(shè)計(jì)模式體系。1. 植物對病原菌的識別機(jī)制和新模式的建立（1）作物對病原菌非?；宰R別及其模式體系（PTI）采用正向和反向遺傳學(xué)結(jié)合生物化學(xué)、組學(xué)等方法，鑒定和分離重要作物（水稻、麥類作物）對重要細(xì)菌和真菌病害病原相關(guān)分子模式（PAMP）的識別受體，如識別脂多糖（LPS ） 、鞭毛蛋白（flagellin）的受體，分析作物中這類受體識別對應(yīng) PAMP 分子的分子機(jī)制、激活基礎(chǔ)抗性的特點(diǎn)，并探討在重要作物生產(chǎn)中如何應(yīng)用這類表面免疫受體及基礎(chǔ)抗性的可能途徑。（2）作物對病原菌?；宰R別的機(jī)制及其模式體系（ETI）在深化模式植物擬南芥對細(xì)菌效應(yīng)因子（如 AvrPto, AvrPtoB）識別的研究基礎(chǔ)上，從兩方面開展研究：1）闡明重要作物與重要病害的互作模式系統(tǒng)（如水稻-稻瘟菌和白葉枯病；麥類-銹病和白粉病）中作物對重要病害?；R別的機(jī)制，包括抗病蛋白對不同病原（包括不同菌系和小種群）效應(yīng)因子（如來源于 M. oryzae, Xoo, Bgh 的效應(yīng)蛋白）的直接或間接的識別機(jī)制、以及效應(yīng)蛋白在作物內(nèi)靶標(biāo)分子的鑒定；2）深入開展作物新型抗病基因的分離，特別加強(qiáng)對已克隆基因編碼的抗病蛋白識別復(fù)合物的鑒定，并研究這些抗病蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、抗病功能的調(diào)節(jié)。（3）植物非?；悦庖撸≒TI ）與?；悦庖撸‥TI）交互作用（cross-talk）以成熟的擬南芥研究模式為主，解析 PTI 與 ETI 新的交互作用。并以此為基礎(chǔ)，解答作物?；c非?；剐缘幕プ鞴?jié)點(diǎn)。2. 植物免疫的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)研究 MAPK 的免疫信號網(wǎng)絡(luò)及其對防衛(wèi)基因的激活，并解析水稻MAPK 調(diào)控免疫反應(yīng)的機(jī)制和上下游元件，以及在植物中是否存在連接 MAPK與 R 受體的組份。分離并闡明新的重要的 SAR 調(diào)控因子如 SARD（SAR Defective）基因家族。 鑒定與 R 蛋白(TIR-NB-LRR，CC-NB-LRR)受體互作的蛋白因子及其在植物免疫（?；钥共。┲械淖饔?。系統(tǒng)研究腐生菌（小麥赤霉病菌）細(xì)胞水平誘導(dǎo)的寄主基因網(wǎng)絡(luò)，并同活體寄生病原菌（銹?。┑拿庖叻磻?yīng)比較，找到共同的重要節(jié)點(diǎn)基因，研究它們的廣譜抗病功能。3. 植物免疫的表觀遺傳調(diào)控與新體系的建立研究植物由 RNA 沉默介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制在植物抗病免疫中的應(yīng)答模式。深入研究擬南芥 TGS 途徑參與對病原的應(yīng)答，開展水稻的抗病毒 RNA 沉默研究，研究病毒侵染對水稻 sRNAs 表達(dá)的影響，鑒定水稻參與抗病毒的關(guān)鍵的 RNA 干擾途徑。研究植物 RNA 沉默途徑在水稻對白葉枯病抗性中的作用機(jī)制，通過分析大規(guī)模測序技術(shù)得到水稻 sRNAs 表達(dá)譜，尋找目標(biāo) sRNAs 靶標(biāo)，研究它們?nèi)绾螀⑴c植物 RNA 沉默或 R 基因介導(dǎo)的抗性免疫途徑。在農(nóng)作物抗病的理論和實(shí)踐上取得重大突破。4. 植物免疫激素途徑和抗病性與作物產(chǎn)量性狀的關(guān)系通過以激素信號為基礎(chǔ)的抗性途徑對植物發(fā)育（產(chǎn)量）的影響，為作物抗病高產(chǎn)的分子設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。尋找并功能鑒定 SA 生物合成的調(diào)控因子。以水稻為模式，研究作物抗病性對產(chǎn)量性狀影響的機(jī)制：重點(diǎn)研究乙烯的發(fā)育途徑如何參與對病害（稻瘟病）的抗性及其機(jī)制；研究水稻病毒?。≧DV 和RBSDV）侵染導(dǎo)致株高矮化的分子機(jī)理；研究水稻 SAR 基因 OsNPR1 調(diào)控生長素發(fā)育途徑從而調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量性狀的分子機(jī)制，并由此建立利用 OsNPR1 進(jìn)行抗病分子設(shè)計(jì)