阿帕替尼通過下調(diào)VEGFR2-PLC-ERK12通路表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖 臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

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1、前 言 近年來胃癌發(fā)病率和死亡率明顯下降，但胃癌仍然是一個(gè)重要的公眾健康問題。胃癌在中國的發(fā)病率居第2，死亡率居第3，是中國四大特色腫瘤之一。其中，晚期胃癌占60-80%，而現(xiàn)有治療手段獲益有限，5年生存率僅20%。有些無法切除、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌患者無法達(dá)到根治。最佳支持治療（BSC）預(yù)后僅有幾個(gè)月。對(duì)于轉(zhuǎn)移性胃癌，現(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率，提高患者生存率，但毒性較高。近些年來，多種靶向藥物正在進(jìn)行臨床研究，如抗表皮細(xì)胞生長因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制藥。這些靶向治療是未來癌癥治療的趨勢，也符合國家“精準(zhǔn)醫(yī)療”的理

2、念。 抑制腫瘤血管生成，是當(dāng)今抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。當(dāng)腫瘤半徑<2mm時(shí)，它主要依靠擴(kuò)散在細(xì)胞周圍的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣生存。隨著瘤體的增大，腫瘤本身或宿主組織將建立起新生血管網(wǎng)已供給瘤體營養(yǎng)。 阿帕替尼就是一種抑制腫瘤血管生成的新型靶向藥物。它能高度選擇性競爭細(xì)胞內(nèi)VEGFR-2的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤組織新生血管生成。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞也具有一定殺傷力。目前已公布的阿帕替尼Ⅱ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，阿帕替尼組的結(jié)果具有較高統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001 OS&PFS）其中阿帕替尼850mg qd組較安慰劑組中位生存期延長2.3個(gè)月，中位PFS延長2.3個(gè)月。近期公布的阿

3、帕替尼Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿帕替尼組總生存期（OS）比安慰劑組延長1.8個(gè)月（median OS 6.5 vs.4.7 months, HR 0.71, P=0.01），中位PFS也被顯著延長（2.6 vs.1.8 months, HR 0.44, P<0.001）。阿帕替尼的臨床試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。 紫杉醇是一種抗微管藥物，能特異性的結(jié)合到腫瘤細(xì)胞的微管β位上，使微管聚合成團(tuán)塊或束狀，使其穩(wěn)定性增加，從而抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管網(wǎng)的正常重組，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。在各項(xiàng)研究中，紫杉醇單藥治療晚期胃癌的有效率17%～23%。早期Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明紫杉醇和其他藥物無交叉耐藥，也沒有毒性相加或重疊。在RAI

4、NBOW研究中，紫杉醇與另一種抗VEGFR2藥物雷莫蘆單抗聯(lián)用，被證實(shí)要由于單用紫杉醇組，無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）明顯延長，因此，抗VEGFR2靶向藥物與紫杉醇聯(lián)用，成為胃癌治療領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向。 目前阿帕替尼主要適用于接受過2種系統(tǒng)化療后進(jìn)展或復(fù)發(fā)的晚期胃癌患者，屬于胃癌治療的三線藥物，對(duì)晚期胃癌患者生存期的延長有著良好的效果。然而，目前尚未有臨床研究涉及阿帕替尼在早期及中期胃癌方面的治療，如果在胃癌的早期使用阿帕替尼，是否能通過對(duì)腫瘤血管生成的抑制有效遏制胃癌的進(jìn)展；阿帕替尼與紫杉醇聯(lián)用是否對(duì)胃癌細(xì)胞有更好的殺滅作用，這些都尚不得而知。 本課題旨在從細(xì)胞、蛋白水平

5、研究阿帕替尼單藥與胃癌化療藥物紫杉醇聯(lián)用后的相互作用及其可能機(jī)制，為臨床治療提供一定的啟示。 一、材料與方法 （一）實(shí)驗(yàn)材料 1.實(shí)驗(yàn)室 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 2.細(xì)胞株 人低分化胃腺癌細(xì)胞株MGC-803（購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫） 3.實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 阿帕替尼（Apatinib）：江蘇恒瑞公司 PRMI-1640培養(yǎng)基：美國GIBCO公司 胎牛血清（FBS）：美國GIBCO公司 PBS：美國Thermo公司 二甲基亞砜（DMSO）：美國Thermo公司 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）：美國Sigma公司 胰蛋白酶-EDTA消化液：So

6、larbio公司 CCK-8試劑盒：康為世紀(jì) Annexin VFITC/IP 凋亡檢查試劑盒：康為世紀(jì) 周期檢測試劑盒：康為世紀(jì) 抗β-actin單克隆抗體：美國Proteintech公司 抗PKC, p-PKC(α/βⅡThr683/641)：美國CST公司 p44/42 MAPK (ERK1/2) ：美國CST公司 p-p44/42 MAPK (p-ERK1/2) (Thr202/Tyr204) ：美國CST公司 紅色上樣緩沖液：美國CST公司 紫杉醇（Paclitaxel）：美國Sigma公司 4.主要儀器設(shè)備 Forma ClassⅡA2生物安全柜（Therm

7、o，美國）；Forma 3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；SORVALL ST 16R離心機(jī)（Thermo，美國）；-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國）；4℃冰箱（海爾，中國），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（BD，美國）；Power-pac基礎(chǔ)電泳儀Bio-Rad，美國）；ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；10-100ul、100-1000ul可調(diào)移液器 （Eppendorf, 德國）； 20-200ul八道可調(diào)移液器（High Tech Lab, 波蘭）。 （二）實(shí)驗(yàn)方法

8、 （1）細(xì)胞培養(yǎng)： 人胃癌細(xì)胞株MGC803培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，5％CO2，37℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。細(xì)胞傳代使用0.1%胰酶溶液（含0.02% EDTA）消化，置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）環(huán)境下，1-2min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。細(xì)胞凍存時(shí)常規(guī)將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后離心，棄上清，使用適量含有20%胎牛血清及4%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，放入含有異丙醇的凍存盒，以按-1℃／min的速度降溫，降至-80℃后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。 （2）細(xì)胞生長曲線測定： 取生長狀

9、況良好的MGC-803細(xì)胞，胰酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5*10^3、1*10^4、2*10^4、3*10^4、4*10^4、5*10^4，均勻接種于96孔板中，每孔加入200μl，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，共接種6塊96孔板，置于5％CO2，37℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)12/24/36/48/60/72小時(shí)后，小心吸取上清液，用CCK-8法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制MGC-803細(xì)胞生長曲線。 （3）CCK-8法測定細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)： A．試驗(yàn)原理： CCK-8試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二

10、磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。可使用酶標(biāo)儀根據(jù)溶液吸光度變化比較細(xì)胞相對(duì)數(shù)目變化，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。 B．試驗(yàn)分組： 空白對(duì)照組：不加細(xì)胞，只有培養(yǎng)液； 細(xì)胞對(duì)照組：只有細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物； 阿帕替尼單用組：只加阿帕替尼，設(shè)7個(gè)濃度水平，相鄰濃度之間2倍稀釋； 紫杉醇單用組：只加紫杉醇，設(shè)7個(gè)濃度水平，相鄰濃度之間2倍稀釋； 聯(lián)合用藥組：根據(jù)Cho

11、u-Talalay聯(lián)合指數(shù)法原則，分別設(shè)置阿帕替尼與紫杉醇各5個(gè)濃度水平：水平1：阿帕替尼濃度3+紫杉醇濃度3；水平2：阿帕替尼濃度4+紫杉醇濃度4；水平3：阿帕替尼濃度5+紫杉醇濃度5；水平4：阿帕替尼濃度6+紫杉醇濃度6；水平5：阿帕替尼濃度7+紫杉醇濃度7（如下表所示）。 表1：聯(lián)合用藥組說明：根據(jù)Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法原則，設(shè)5個(gè)濃度水平。 紫杉醇濃度 濃度1 濃度2 濃度3 濃度4 濃度5 濃度6 濃度7 阿帕替尼濃度 濃度1 濃度2 濃度3 濃度4

12、 濃度5 濃度6 濃度7 藥物配置：阿帕替尼干粉-20℃保存，用DMSO溶解成10mM儲(chǔ)存液，-80℃?zhèn)溆?，使用時(shí)用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。紫杉醇用DMF溶解成10mM儲(chǔ)存液，-80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。 C．試驗(yàn)步驟： 取對(duì)數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3*10^4進(jìn)行鋪板，每孔180μl（約5000個(gè)細(xì)胞/孔），接種于96孔板，5％CO2，37℃環(huán)境中靜

13、置培養(yǎng)6h后備用。 100μM阿帕替尼倍比稀釋7個(gè)濃度，實(shí)驗(yàn)組加入20μl不同濃度的阿帕替尼，空白組加入20μl 1640培養(yǎng)液，空白對(duì)照組不加細(xì)胞，只有等量培養(yǎng)液。置于5％CO2，37℃環(huán)境中培養(yǎng)24h后，用吸引器吸去每孔液體，加入RPMI1640：CCK-8=10:1配置的溶液110μl。置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育，2小時(shí)后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值。 中效濃度（Dm）的計(jì)算（即半數(shù)抑制濃度（IC50）） 根據(jù)A450計(jì)算細(xì)胞存活率（fu）： 細(xì)胞生存率（fu）=實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值 根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算藥物抑制率（fa

14、）： 細(xì)胞抑制率（fa）=1-生存率（fu）=對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值 將中效方程式fafu=（DDM）m兩邊取對(duì)數(shù)得： log（fafu）=log（DDm）m=mlogD-mlogDm 設(shè)Y= log（fafu），X=logD，則可得直線方程： Y=mX + a (其中m為斜率，a為截距) 當(dāng)Fa=0.5時(shí)，X=logDm= - am ,可計(jì)算出阿帕替尼及紫杉醇單用及聯(lián)合用藥時(shí)的Dm值。 聯(lián)合用藥效果判定： 由中效方程fafu=（DDM）m可得：D=Dm（fafu）1/m 當(dāng)fa=0.1、0.2……0.8、0.9時(shí)，即可

15、計(jì)算出兩藥聯(lián)合所需濃度（D）；運(yùn)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法中的量效公式計(jì)算出量效聯(lián)合時(shí)的聯(lián)合用藥指數(shù)（CI）： CIx=D1Dx1+D2Dx2+αD1D2Dx1Dx2 結(jié)果判定： CI值 強(qiáng)度 結(jié)果 <0.1 ＋＋＋＋＋ 超強(qiáng)聯(lián)合 0.1-0.3 ＋＋＋＋ 強(qiáng)聯(lián)合 0.3-0.7 ＋＋＋ 聯(lián)合 0.7-0.85 ＋＋ 中等聯(lián)合 0.85-0.90 ＋ 弱聯(lián)合 0.90-1.10 相加 1.10-1.20 － 弱拮抗 1.20-1.45 －－ 中等拮抗 1.45-3.3 －－－ 拮抗 3,3-10 －－－－ 強(qiáng)

16、拮抗 >10 －－－－－ 超強(qiáng)拮抗 （4）碘化丙啶染色法（Propidium Iodide Staining）測定細(xì)胞周期： 實(shí)驗(yàn)原理： 碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一種可以嵌合到雙鏈DNA和RNA的堿基對(duì)中并與之結(jié)合的熒光染料，無堿基特異性。碘化丙啶與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被PropidiumIodide染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的分析。 實(shí)驗(yàn)步驟： 取對(duì)數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，用0.1%胰酶溶液消化成單細(xì)

17、胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為610^4/ml進(jìn)行鋪板，每孔單細(xì)胞懸液2ml,接種于12孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個(gè)濃度，各實(shí)驗(yàn)組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液及貼壁細(xì)胞，冰浴預(yù)冷的95%乙醇固定細(xì)胞12小時(shí)后予碘化丙啶染色。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況，數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，得出細(xì)胞各周期比例。 （5）Annexin-V/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡： 實(shí)驗(yàn)原理： 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋

18、亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)步驟： 取對(duì)數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，用0.1%胰酶溶液消化成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為610^4/ml進(jìn)行鋪板，每孔單細(xì)胞懸液2ml,接種于12孔板，置于37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，吸去培養(yǎng)液。80μM阿帕替尼倍比稀釋5個(gè)濃度，各實(shí)驗(yàn)組加入2ml含不同濃度阿帕替尼的培養(yǎng)液，空白組加入2ml完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h，小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液及貼

19、壁細(xì)胞。1000r/min離心5min，沉淀細(xì)胞。冰浴預(yù)冷的PBS洗滌兩次，再次離心沉淀細(xì)胞。用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer 250μl重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1106/ml；取100 μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5 μl Annexin V／FITC和10 μl 20μg／ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15min，然后在反應(yīng)管中加入400μl PBS，流式細(xì)胞儀（FACS），分析數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，得出細(xì)胞凋亡率。 （6）Western blot蛋白印記分析： 實(shí)驗(yàn)原理： 蛋白印跡（Western blot）又被稱作免疫印跡，是一種被廣泛應(yīng)用并得到公認(rèn)的技

20、術(shù)，用于檢測組織或細(xì)胞提取物中蛋白表達(dá)水平。Western blot技術(shù)利用抗體與特定待檢測的蛋白結(jié)合，測定生物樣品中的蛋白表達(dá)水平?？贵w與其靶點(diǎn)蛋白表位的精確結(jié)合可用于檢測蛋白質(zhì)中具有高度特異性的氨基酸序列?？贵w也可檢測蛋白質(zhì)的特異性翻譯后修飾（PTM）。 溶液配制： 1）10%過硫酸銨： 將1g過硫酸銨溶解于10ml去離子水中，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩? 2）SDS上樣緩沖液： Tris-HCL（1M PH6.8） 1ml 10%SDS 4ml DTT（1M） 1ml 臺(tái)盼藍(lán)

21、 0.02g 去離子水 終體積為100ml 3）SDS-PAGE甘氨酸電泳緩沖液 Tris堿 15g 甘氨酸 94g SDS 1g 去離子水 終體積為1000ml 3）TBS緩沖液 Tris-HCL（1M PH7.5） 100ml NaCL 9g 去離子水 終體積為1000ml 4）TBST液

22、 1000ml TBS緩沖液中加入1ml Tween-20至終濃度為0.1% 5）轉(zhuǎn)模緩沖液 Tris堿 3.03g 甘氨酸 14.41g 甲醛 100ml-200ml 去離子水 終體積為1000ml 注：根據(jù)蛋白分子量不同調(diào)整甲醛濃度（10%-20%之間） 6）封閉液 用TBST溶液將脫脂奶粉配制成5%封閉液。 7）分離膠和濃縮膠配制： 分離膠制備如下以（10ml體積為例）： 6% 8% 10% 12%

23、 去離子水 5.3ml 4.6ml 4.0ml 3.3ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 2.7ml 3.3ml 4.0ml 1.5M Tris（PH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 10%過硫酸銨 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TEMED 0.08ml 0.006ml 0.04ml 0.04ml 濃縮膠制備如下： 總體積5ml 去離子水 2.77ml 30%丙烯酰胺 0，83 ml 0.5M Tris（PH8.8）

24、 1.26 ml 10%SDS 0.05ml 10%過硫酸銨 0.05ml TEMED 0.005ml 8）蛋白樣品制備： 1. 從培養(yǎng)瓶中去除培養(yǎng)液，用1X PBS輕柔洗滌細(xì)胞兩次，吸凈PBS。 2. 加入1X SDS樣本緩沖液（6孔板中每孔加入100ul，直徑10ml培養(yǎng)皿中加入500ul）裂解細(xì)胞。立即刮下細(xì)胞，用移液槍轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，置于冰上備用。 3. 超聲裂解10-25秒，完成細(xì)胞裂解和剪切DNA。 4. 95℃水浴中加熱5分鐘，在冰上冷卻。 5. 將冷卻后樣本離心5分鐘，-80℃保存?zhèn)溆谩? 9）BCA法測定蛋白濃度： 實(shí)驗(yàn)原理： 在

25、堿性溶液環(huán)境中，二價(jià)銅離子（Cu2+）可與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的肽鏈結(jié)構(gòu)形成絡(luò)合物，同時(shí)蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子（Cu2+）還原成一價(jià)亞銅離子（Cu+）。BCA試劑可題型地與一價(jià)亞銅離子（Cu+）結(jié)合，形成穩(wěn)定的有色復(fù)合物，可在562nm波長處檢查該復(fù)合物的最大吸收光，所測定的吸光度值（OD）與蛋白質(zhì)濃度成正比。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出被測蛋白質(zhì)的濃度。 實(shí)驗(yàn)步驟： A． 根據(jù)試劑盒說明書，相鄰濃度2倍稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品（2μg/μl），得到0 μg/μl、0.0625 μg/μl、0.125 μg/μl、0.25 μg/μl、0.5 μg/μl、1 μg/μl、2 μg/μl共7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度；

26、 B． 計(jì)算BCA工作液總量： BCA工作液總量=（BCA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)+位置樣本個(gè)數(shù)）x復(fù)孔數(shù)x每個(gè)樣本BCA工作液體積 根據(jù)計(jì)算出的BCA工作液所需總量，將試劑A和試劑B按照50：1的體積比，配置BCA工作液，充分混勻。 C． 將稀釋好的A-G BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白質(zhì)樣品（原液或樣品）各25μl分別加到做好標(biāo)記的96孔板中。每個(gè)測定樣本做3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。 D． 加入200μl BCA工作液。平板搖床混勻30秒。 E． 37℃環(huán)境下孵育30分鐘后冷卻至室溫。 F． 用酶標(biāo)儀在540-590nm范圍內(nèi)測定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

27、 10）SDS-PAGE電泳 A．清洗玻璃板： 去污劑輕輕擦洗玻璃板兩面，去除表面污漬，清水沖洗干凈后，使用蒸餾水沖洗，然后晾干備用。可用無水乙醇擦拭晾干后，用玻璃紙隔離保存。梳子使用前用水洗凈，臨使用前用無水乙醇擦拭后晾干。 B．玻璃板檢漏： 玻璃板在水平桌面上對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上，往玻璃板間灌水，靜置15分鐘觀察液面是否下降，若出現(xiàn)漏液則需查明原因后重新放置玻璃板，并再次檢漏，若無漏液，則將玻璃板間液體輕輕倒去，殘余液體用濾紙吸干。 C．灌膠與上樣： 按目標(biāo)蛋白分子量選擇合適的分離膠濃度配置，成分詳見上表，最后加入TEMED，配制分離膠時(shí)要充分混勻

28、，可用1000μl移液槍輕輕吹打，此外應(yīng)保證試劑在使用期內(nèi)，特別是過硫酸銨。灌膠時(shí)動(dòng)作輕柔，掌握好速度，避免小氣泡產(chǎn)生（濃度越小的分離膠含水越多，膠凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層異丙醇?jí)耗z，壓膠后的膠凝的更平整、更快（灌膠時(shí)開始可稍快一些，膠面快到所需高度時(shí)可放慢速度。操作時(shí)膠需要沿玻璃板邊緣流下，可避免產(chǎn)生氣泡。加異丙醇液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。操作時(shí)帶好手套口罩等防護(hù)措施，因?yàn)槲淳酆系谋０肪哂幸欢ㄉ窠?jīng)毒性。 待分離膠凝固后，棄取表面壓膠的異丙醇，殘余異丙醇可用濾紙小心吸干，按上表成分配制濃縮膠，最后加入TEMED，之后輕輕搖勻，避免混入氣泡。將濃縮膠小心灌入，將玻璃

29、板間剩余空間灌滿后可將梳子水平插入濃縮膠中。灌濃縮膠時(shí)也要使膠沿玻璃板邊緣流下，避免灌膠過程中有氣泡產(chǎn)生。根據(jù)樣本數(shù)目選擇十孔或十五孔的梳子，插梳子時(shí)要保持水平。由于濃縮膠凝固時(shí)體積也會(huì)收縮減小，使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 取下梳子后后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，注意勿裝反，加入適量電泳也液后續(xù)檢漏，直至無明顯液體漏出后，繼續(xù)加入電泳緩沖液至刻度線后后開始準(zhǔn)備上樣。在加樣前可使用10μl移液槍輕輕吹打一下加樣孔。一般在第一個(gè)孔加入marker，將要加入的樣品混合均勻，加樣前樣品可先離心，

30、尤其是長時(shí)間放置的樣品。用合適的移液器貼壁吸取樣品，注意將樣品吸出不要產(chǎn)生氣泡。將加樣器槍頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。上樣時(shí)，注意不要使樣品溢出而污染相臨的加樣孔。加樣完成后，將電泳液補(bǔ)充至刻度線。 D．電泳 上樣完畢后，蓋好電泳槽蓋子，注意電源正負(fù)極進(jìn)行電泳。上層濃縮膠采用70V電壓，待條帶跑至分離膠時(shí)，將電壓調(diào)節(jié)至110V，直至溴酚藍(lán)染料前端至凝膠末端處為止，電泳時(shí)間約 2-3 小時(shí)。 E．轉(zhuǎn)膜 1. 電泳結(jié)束后取出凝膠，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中漂洗數(shù)秒后。按以下順序放置：陰極轉(zhuǎn)模板+海綿+濾紙+膠+PVDF膜+濾紙+海綿+陽極轉(zhuǎn)模板，放置過程中注意要將膠與PVDF膜浸沒在轉(zhuǎn)膜液中，放置P

31、VDF膜后剪角作標(biāo)記。固定完成后插入轉(zhuǎn)膜槽中，確保正負(fù)極正確，用轉(zhuǎn)膜液浸沒。將整個(gè)轉(zhuǎn)膜槽放置入冰盒中，開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜選擇恒流，建議電流為 150-300mA,時(shí)間依據(jù)膠的濃度適當(dāng)調(diào)整。 F．膜封閉： 1． 轉(zhuǎn)模完成之后，室溫下用1X TBS洗滌PVDF膜5分鐘。 2． 室溫條件下，置于封閉液中孵育膜1小時(shí)，搖床持續(xù)緩慢搖晃。 3． 剪膜后，室溫下用1X TBST洗滌5分鐘。 G． 抗體孵育： 1.一抗孵育： 按說明書稀釋方式吸取抗體后，立即加入一抗稀釋液中，可在室溫下用側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)或4℃下緩慢搖動(dòng)孵育過夜。一抗孵育完成后，在搖床上用TBST洗滌5分鐘。

32、 2.二抗孵育： 二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，稀釋完成后，在室溫下側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。孵育完成后，在搖床上用TBST洗滌3遍，每次5分鐘。 H． 曝光 將A和B兩種顯影劑混合后備用，將膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)焦距與位置后，滴入適量混合后的顯影劑，開始曝光。根據(jù)不同蛋白調(diào)節(jié)曝光時(shí)間。 （8）免疫組化 免疫組化采用預(yù)制組織芯片，有完善的隨訪資料。 將石蠟切片于55℃-60℃烤箱中烘烤1-1.5h使石蠟熔化。然后取出切片迅速置于二甲苯染色缸中脫蠟3次，每次3分鐘。脫蠟完成后，將切片分別置于無水乙醇3次，每次2分鐘，置于95%乙醇3次，每

33、次2分鐘。然后置于70%酒精2分鐘，最后在蒸餾水中輕晃漂洗2分鐘。洗滌完成后，將切片置于10mM檸檬酸鹽緩沖液中95℃以上修復(fù)抗原修復(fù)完成后，冷卻至室溫，用雙蒸水洗滌10分鐘。 在37℃濕盒中使用與二抗來源相同的血清封閉1小時(shí)。去除封閉液滴加一抗后在4℃濕盒孵育過夜。然后使用PBST在搖床上漂洗5分鐘，再使用PBS在搖床漂洗4次，每次5分鐘。按照說明書推薦濃度滴加相應(yīng)二抗，在37℃濕盒孵育20-30分鐘，然后使用PBS在搖床漂洗3次，每次5分鐘。3%H2O2封閉10分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物酶。再使用蒸餾水漂洗，最后PBS漂洗3次，每次3分鐘。 滴加SABC后在37℃中濕盒孵育20分鐘，PBST

34、搖床漂洗4次，每次5分鐘，PBS洗滌2次，每次5分鐘。DAB染色：將現(xiàn)配DAB染液滴加至組織處，置于鏡下觀察染色，直至陽性染色出現(xiàn)后使用蒸餾水沖洗1次，然后后PBS漂洗2分鐘。 蘇木素復(fù)染：滴加蘇木素至玻片上，染色后使用蒸餾水緩慢沖洗，直至洗完全洗凈蘇木素。蘇木素染色在堿性條件下呈現(xiàn)藍(lán)色，在酸性條件下呈現(xiàn)棕色，分別使用鹽酸及氨水調(diào)整返蘭時(shí)間使蘇木素染色為淡藍(lán)色。 最后按照與脫蠟復(fù)水相反的順序進(jìn)行脫水，脫水后使用中性樹膠封片。 （7）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(xs)表示，多組之間比較采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二、結(jié) 果 1

35、.MGC-803的細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)設(shè)置5*10^3/ml、1*10^4/ml、2*10^4/ml、3*10^4/ml、4*10^4/ml、5*10^4/ml六個(gè)細(xì)胞濃度，每隔12小時(shí)觀察細(xì)胞生長情況（共計(jì)72小時(shí)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OD值（吸光度值）隨著細(xì)胞濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。大約48小時(shí)后，細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，所以根據(jù)細(xì)胞生長曲線情況，選定3*10^4/ml為實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞濃度。 2.阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇對(duì)MGC-803細(xì)胞的時(shí)效及量效關(guān)系： 阿帕替尼單用對(duì)MGC-803細(xì)胞生長的影響： 紫杉醇單用對(duì)MGC-803細(xì)胞生長的影響：

36、 阿帕替尼與紫杉醇聯(lián)用對(duì)MGC-803細(xì)胞生長的影響： Chou-Talalay聯(lián)合用藥曲線 三、分析與討論 近年來胃癌發(fā)病率和死亡率逐年下降，但胃癌仍然是一個(gè)重要的公眾健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球胃癌新發(fā)病例約95萬（951000例），占所有癌癥比例為6.8%。胃癌在中國的發(fā)病率居第二，死亡率居第三，是中國四大高發(fā)腫瘤之一[1,2]。目前早期胃癌可通過內(nèi)鏡或手術(shù)治療，5年生存率接近90%。但我國的胃癌檢測尚未普及，很多胃癌病例是被機(jī)會(huì)性發(fā)現(xiàn)，早期胃癌僅占10%。對(duì)于進(jìn)展期胃癌，根治性手術(shù)治療后5年生存率為50%左右。對(duì)于無法手術(shù)切除、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌患者，最佳

37、支持治療（BSC）預(yù)后僅有幾個(gè)月[8]。目前在胃癌外科治療領(lǐng)域已達(dá)成共識(shí)，即單純的手術(shù)無法完成生物學(xué)意義上的腫瘤根治，即使接受更廣泛的臟器切除和淋巴結(jié)清掃，亦然獲益有限。因此，胃癌的治療需要以外科手術(shù)為主，輔以其他多種手段（化療、放療、靶向藥物治療、生物治療等）的綜合治療。現(xiàn)有資料顯示，聯(lián)合化療雖然能夠提高疾病的緩解率和患者生存率，但毒性較高，且獲益有限[9,10]。 近些年來，多種靶向藥物進(jìn)入市場，如抗表皮細(xì)胞生長因子受體1（EGFR）和2（HER-2）單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和血管生成抑制劑，取得了不錯(cuò)的臨床效果。相比于傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物，分子靶向藥物具有高選擇性、高效、低毒副作

38、用等特點(diǎn)[3-5]。與其他類型的惡性腫瘤相比，胃癌靶向治療的發(fā)展相對(duì)滯后，但仍取得較大進(jìn)展，雷莫蘆單抗已通過FDA認(rèn)證用于胃癌治療，并被NCCN指南推薦[11,12]；阿帕替尼被證明是對(duì)二線化療失敗的終末期胃癌患者唯一有效的藥物，與最佳支持治療組相比，明顯延長患者的OS和PFS[6,7]。 在以往的研究中，阿帕替尼被認(rèn)為是一種抗血管生成藥物，在抑制腫瘤血管生成方面取得了許多令人鼓舞的成果[13,14]。但其是否對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接作用，相關(guān)研究尚不多，Sui Peng等8證實(shí)阿帕替尼可通過抑制膽管癌（EBDC）細(xì)胞的VEGFR2受體，從而抑制腫瘤細(xì)胞自分泌VEGF的作用，抑制腫瘤的生長[

39、15,16]。Lin C等發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌的治療中，阿帕替尼不僅通過細(xì)胞毒性發(fā)揮其抗癌作用，且還通過抑制RET / Src信號(hào)通路抑制遷移和侵襲[17]。Mi YJ等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可通過抑制轉(zhuǎn)運(yùn)功能來逆轉(zhuǎn)ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥[18]。 本資料中，相比于對(duì)照組，阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803的增殖具有明顯抑制作用，IC50值為（27.92.21）μM，抑制作用呈濃度依賴性，當(dāng)濃度為50μM時(shí)，其抑制率可達(dá)87%。凋亡受阻和細(xì)胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生中的重要因素，因此為初步探討其可能存在的機(jī)制，作者對(duì)試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行凋亡和周期的檢測。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療中的重要環(huán)節(jié)，但本研究

40、中，不同濃度阿帕替尼作用后的MGC-803細(xì)胞與對(duì)照組相比凋亡率無明顯區(qū)別。因此作者認(rèn)為阿帕替尼并非通過誘導(dǎo)凋亡來抑制MGC-803細(xì)胞的生長。同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測用阿帕替尼處理24h后MGC-803細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后的細(xì)胞被明顯阻滯于G1期，G2期比例減少，S期細(xì)胞無明顯變化，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞生長失控，導(dǎo)致細(xì)胞無限制增長。化療藥物可將腫瘤細(xì)胞的周期阻滯于G0/G1期，抑制分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)和DNA合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。在本資料中，阿帕替尼表現(xiàn)出類似抑制效果，因此作者認(rèn)為阿帕替尼可通過改變細(xì)胞周期

41、來發(fā)揮抗腫瘤作用。為進(jìn)一步證實(shí)，對(duì)VEGFR2下游的VEGFR2-PLC-ERK1/2通路進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼處理后，磷酸化的PLC與ERK1/2水平明顯下降，且呈濃度依賴性。VEGFR2-PLC-ERK1/2通路被證實(shí)與周期調(diào)控和細(xì)胞增殖關(guān)系密切，活化的ERK1/2通過磷酸化激活Jun癌基因（c-Jun），導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞增殖[20,21]。蛋白免疫印跡試驗(yàn)與細(xì)胞增殖抑制和周期受阻結(jié)果符合。 綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細(xì)胞株MGC-803的增殖，并將其阻滯于G1期，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，且該結(jié)果與細(xì)胞凋亡無關(guān)。引起這一現(xiàn)象的原因，可能是阿帕替尼抑制VEGFR2-PLC-ERK1/2通路關(guān)鍵蛋白磷酸化，造成MGC-803細(xì)胞DNA合成受阻，生長受限。此外，用阿帕替尼長期處理MGC803細(xì)胞后，會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥，為進(jìn)一步研究這一現(xiàn)象，將做更多研究。 17