臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究

《臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究（13頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究 [摘要] 目的 探索上海東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫低溫凍存0～10年肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸的質(zhì)量。方法 隨機(jī)抽取2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌標(biāo)本30份。1％瓊脂糖凝膠電泳和RIN值評估法檢測RNA完整性。 結(jié)果 將組織標(biāo)本按凍存年限分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論 長期低溫時(shí)間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RN

2、A存在嚴(yán)重的降解。 [關(guān)鍵詞] 生物樣本；肝細(xì)胞癌；低溫保存；核糖核酸；質(zhì)量控制； 前言 腫瘤分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究對高質(zhì)量新鮮腫瘤標(biāo)本的需求日益增長，生物樣本庫建設(shè)是后基因組時(shí)代的重要課題。全球范圍內(nèi)各研究機(jī)構(gòu)建立有較為完善的腫瘤生物標(biāo)本庫(1-5)，不僅為腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究提供重要的標(biāo)本，并在核酸與蛋白質(zhì)的提取、分析和建立腫瘤細(xì)胞系方面取得成果(6-8)。上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫自2008年起開展肝癌生物樣本庫建設(shè)，在闡明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制上提供了大量有價(jià)值的生物樣本(9-15)。目前，有較大比例生物樣本保存時(shí)間已經(jīng)長達(dá)10年之久。為分析長期冷凍保存腫瘤樣本是否

3、適合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，本文探討了低溫樣本庫的儲存年限與核糖核酸的分子完整性關(guān)系，以期為高質(zhì)量生物樣本庫建設(shè)以及腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供參考。 1 材料與方法 1.1 肝細(xì)胞癌樣本 隨機(jī)抽取上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫中2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本30份。所有樣本均為我院肝癌外科資深醫(yī)師行肝癌根治術(shù)切取的肝癌標(biāo)本，標(biāo)本離體后30min內(nèi)取材、分裝在低溫凍存管后投于液氮內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存。低溫凍存時(shí)間在0至10年不等。樣本編號T代表肝細(xì)胞癌組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本編號與儲存時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系見表1。 表1：標(biāo)本編號與低溫儲存時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系

4、 儲存年份 組織樣本 儲存時(shí)間 (年） T(腫瘤組織) 2008 08-1T﹑08-2T﹑08-3T 10 2009 09-1T﹑09-2T﹑09-3T 9 2010 10-1T﹑10-2T﹑10-3T 8 2011 11-1T﹑11-2T﹑11-3T 7 2012 12-1T﹑12-2T﹑12-3T 7 2013 13-1T﹑13-2T﹑13-3T 5 2014 14-1T﹑14-2T﹑14-3T 4 2015 15-1T﹑15-2T﹑15-3T 3 2016 16-1T﹑16-2T﹑16-3T 2 2017 17-1T﹑

5、17-2T﹑17-3T 1 1.2 樣本中腫瘤細(xì)胞含量評估 上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫所有組織均同時(shí)留存一份于10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋后制備組織切片，由本院擁有5年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行腫瘤組織學(xué)分類以及腫瘤細(xì)胞含量評估，本研究所有樣本的腫瘤細(xì)胞含量均大于60％。 1.3 核糖核酸抽提與質(zhì)控 RNA抽提采用Trizol(寶生,大連,中國)抽提法。分光光度計(jì)測定A260/A280比值，1％瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA條帶。RNA上樣量為4ul，電泳時(shí)間30min，于凝膠圖像分析儀觀察電泳條帶；Agilent2100生物分析儀測量RNA完整數(shù)值(RNA

6、integrity number，RIN)。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。RNA的濃度、A260/A280比值、RIN值采用單向ANOVA檢驗(yàn)。組間構(gòu)成比采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1長期低溫時(shí)間對樣本抽提RNA濃度影響 首先采用檢測了不同低溫保存年限的RNA濃度(ng/μL)。將組織標(biāo)本按照低溫凍存年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年和>9年，四組肝癌組織的RNA濃度分別為724.4 50.9﹑691.4 42.5﹑717.5 35.6﹑和618.5 34.5，各組之間RNA濃度沒有顯著性差

7、異(圖1，F(xiàn)=1.111，P=0.363)。可見，長期低溫凍存對腫瘤組織樣本RNA濃度無影響。 2.2長期低溫時(shí)間對樣本抽提A260/A280影響 將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，統(tǒng)計(jì)分析了四組間A260/A280差異，四組腫瘤的A260/A280比值分別為1.910.05﹑1.90 0.04﹑1.90 0.03﹑和1.93 0.04187,各組之間沒有顯著性差異(圖2，F(xiàn)=0.143，P=0.933)?？梢?，長期低溫凍存對腫瘤組織樣本A260/A280無影響。 2.3 長期低溫時(shí)間樣本對抽提RNA RIN影響 接下來比較了四組之間RIN值差異

8、，將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，四組腫瘤的RIN值分別為8.380.56﹑7.78 0.36﹑5.780.48﹑和4.23 0.34，如圖3所示，<2年和3-5年兩組RIN值無差別(F=0.983，P=0.340)；6-8年組RIN值比較3-5年組RIN值有明顯下降(F=10.860，P=0.005)；>9年RIN值比較6-8年組有明顯下降(F=5.399，P=0.037)。提示凍存時(shí)間超過5年的標(biāo)本RNA質(zhì)量成逐年下降趨勢。 2.4 RNA分子完整性及質(zhì)量分級 依照在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上28S與18S條帶情況以及RIN值將樣本RNA質(zhì)量與完整性分為

9、A,B,和C 3級。在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上有清晰的28S與18S兩條主帶且RIN大于7定義為A，若能看到兩條帶但清晰度下降且28S條帶模糊定義為B且RIN值大于4定義為B，若28S與18S兩條帶均消失呈涂抹狀或RIN值小于4則定義為C。本組樣本RNA分子的質(zhì)控檢測與儲存年限關(guān)系見表2。 本研究組將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，各個(gè)A、B、C級樣本數(shù)目之比為5:1:0、6:3:0、1:6:2和0:3:3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示樣本低溫凍存5年以內(nèi)A、B、C級樣本數(shù)目之比無明顯差異(P=0.604)，A、B、C級樣本數(shù)目比例在低溫凍存>9年組和3-5年組比較存在差

10、異(P=0.013)；樣本低溫凍存6-8年，A、B、C級樣本數(shù)目比例比較3-5年組也存在差異(P=0.037)；但是樣本低溫凍存6-8年與低溫凍存>9年組A、B、C級樣本數(shù)目比例無差異(P=0.435)。提示凍存時(shí)間超過5年的標(biāo)本RNA提取高質(zhì)量樣本的數(shù)目銳減。 3 討論 腫瘤生物樣本庫的核心是溫度與質(zhì)量，國際上在樣本核酸質(zhì)量分析中，A260，A280及其比值是判斷RNA樣本純度的指標(biāo)；RNA的完整性可用瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測法(16)。A260代表核酸(RNA)吸光度，A280代表蛋白質(zhì)吸光度。純凈的RNA其A260/A280比值

11、為1.7～2.0，比值<1.7表明有蛋白質(zhì)或酚類污染，比值>2.0表明可能有異硫氰酸胍殘留。對于RNA完整性的評價(jià)目前主要有兩種方法，包括瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測法。rRNA占整個(gè)RNA分子的80％，而mRNA僅占RNA分子的3％，故檢測mRNA并不容易，而檢測含量高的rRNA相對容易。在瓊脂糖凝膠電泳中，當(dāng)28S和18S的rRNA條帶亮度比例為2時(shí)便被認(rèn)為RNA完整。RNA是極易降解的生物分子，由于缺血、凋亡及壞死等影響，28S的rRNA比18S的rRNA更易退化，所以28S和18S的比值為2難以實(shí)現(xiàn)。RIN的計(jì)算采用了“RIN軟件算法”，

12、檢測結(jié)果以1到10數(shù)字表示，完整的RNA為10。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，RIN值>7可視為優(yōu)秀，適用于高質(zhì)量的RNA研究，如基因芯片檢測；RIN值為4～7視為良好，可以用于一般分子生物學(xué)研究，如定量PCR；當(dāng)RNA完全降解時(shí)RIN值為1(17, 18)。自RIN檢測方法開發(fā)以來，被廣泛用來評價(jià)RNA完整性。有文獻(xiàn)提出，對于有一定程度RNA降解的樣本，也可以進(jìn)行定量PCR檢測獲得目的基因的相對表達(dá)量，從而提高了一批珍稀樣本利用率。在本研究中，我們依照凍存年限將組織標(biāo)本分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，研究結(jié)果提示各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差

13、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P=0.018)。高質(zhì)量的A級別RNA質(zhì)量在凍存5年以上組所占比例開始降低，由此提示長期低溫時(shí)間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RNA存在嚴(yán)重的降解。本研究不足之處在于僅對肝癌組織樣本RNA質(zhì)量進(jìn)行評估，缺乏對癌旁組織和正常肝組織樣本RNA質(zhì)量評估，我們將在接下來的研究中進(jìn)一步深入探討。 [參考文獻(xiàn)] 1. Barry W. National tumor bank set up in United king

14、dom. Journal of the National Cancer Institute. 2003;95(10):706. 2. Huiling L, Yuan Q, Xin Z, Xin X, Dongjiang L, Wei W, et al. Establishment of a lung cancer biobank of a southern chinese population. Journal of Thoracic Disease. 2009;1(1):17-22. 3. Matzke EA, ODonoghue S, Barnes RO, Daudt H, Cheah

15、 S, Suggitt A, et al. Certification for biobanks: the program developed by the Canadian Tumour Repository Network (CTRNet). Biopreservation & Biobanking. 2012;10(5):426. 4. Riegman PHJ, Dinjens WNM, Oomen MHA, Spatz A, ., Ratcliffe C, ., Knox K, ., et al. TuBaFrost 1: Uniting local frozen tumour ba

16、nks into a European network: an overview. European Journal of Cancer. 2006;42(16):2678-83. 5. Vaught J, Rogers J, Myers K, Lim MD, Lockhart N, Moore H, et al. An NCI Perspective on Creating Sustainable Biospecimen Resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011;2011(42):1-7. 6. Bao, Wei-Guang, Zhang, X

17、ia, Zhang, Jian-Gang, et al. Biobanking of Fresh-frozen Human Colon Tissues: Impact of Tissue Ex-vivo;Ischemia Times and Storage Periods on RNA Quality. Annals of Surgical Oncology. 2013;20(5):1737-44. 7. Troyer D. Biorepository standards and protocols for collecting, processing, and storing human

18、tissues. Methods in Molecular Biology. 2008;441:193. 8. Zhu ZG, Yu YY. Significance of biological resource collection and tumor tissue bank creation. World J Gastrointest Oncol. 2010;2(1):5-8. 9. Yu J, Xu QG, Wang ZG, Yang Y, Zhang L, Ma JZ, et al. Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metasta

19、sis in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 2018;68(6). 10. Yuan JH, Yang F, Wang F, Ma JZ, Guo YJ, Tao QF, et al. A long noncoding RNA activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma. Cancer cell. 2014;25(5):666-81. 11. Yuan SX, Wang J, Yang

20、F, Tao QF, Zhang J, Wang LL, et al. Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepression of CTNNB1. Hepatology. 2016;63(2):499-511. 12. Liu F, Yuan J, Lt, Huang J, Yang F, Wang T, et al. Long noncoding RNA FTX inhibits hepatocellular carcinoma proliferati

21、on and metastasis by binding MCM2 and miR-374a. Oncogene. 2016;35(41):5422. 13. Xu QG, Yuan SX, Tao QF, Yu J, Cai J, Yang Y, et al. A novel HBx genotype serves as a preoperative predictor and fails to activate the JAK1/STATs pathway in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2019. 14. Fang W, Ji-Hang

22、 Y, Shao-Bing W, Fu Y, Sheng-Xian Y, Chen Y, et al. Oncofetal long noncoding RNA PVT1 promotes proliferation and stem cell-like property of hepatocellular carcinoma cells by stabilizing NOP2. Hepatology. 2014;60(4):1278–90. 15. Zhou CC, Yang F, Yuan SX, Ma JZ, Liu F, Yuan JH, et al. Systemic genome

23、 screening identifies the outcome associated focal loss of long noncoding RNA PRAL in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2016;63(3):850-63. 16. Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, Leiber M, Gassmann M, et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measu

24、rements. BMC molecular biology. 2006;7:3. 17. Jeffries MKS, Kiss AJ, Smith AW, Oris JT. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. Bmc Biotechnology. 2014;14(1):94. 18. Morrissy S, Zhao Y, Delaney A, Asano J

25、, Dhalla N, Li I, et al. Tag‐Seq: Next‐Generation Tag Sequencing for Gene Expression Profiling2012.  圖1：不同凍存年限樣本RNA濃度在各組之間未見顯著性差異(單向ANOVA檢驗(yàn)，F(xiàn)=1.111，P=0.363) 圖2：不同凍存年限樣本A260/A280在各組之間未見顯著性差異(單向ANOVA檢驗(yàn)，F(xiàn)=1.111，P=0.363)

26、 圖3：不同凍存年限樣本RIN在各組之間數(shù)值 (卡方檢驗(yàn)，# P>0.05;* P<0.05;** P<0.01) 表2：凍存樣本的RNA質(zhì)控分級與儲存年限關(guān)系 肝癌組織(T) 樣本 儲存年限 RNA 編號 （年） 質(zhì)量等級 08-1T 10 B 08-2T 10 C 08-3T 10 C 09-1T 9 C 09-2T 9 B 09-3T 9 B 10-1T 8 B 10-2T 8 C 10-3T 8 B 11-1T 7 B 11-2T 7 A 11-3T 7 B 12-1T 6 B 12-2T 6 B 12-3T 6 C 13-1T 5 B 13-2T 5 B 13-3T 5 A 14-1T 4 A 14-2T 4 A 14-3T 4 A 15-1T 3 B 15-2T 3 A 15-3T 3 A 16-1T 2 A 16-2T 2 A 16-3T 2 A 17-1T 1 A 17-2T 1 B 17-3T 1 A