枸杞多糖的提取與分離研究分析生物技術(shù)專業(yè)

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1、摘要 為了研究枸杞多糖在枸杞中的提取分離更好的方法和提取得率含量最高的方法，本文以單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)枸杞中多糖提取法的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)獲得的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行了放大驗(yàn)證，確定熱浸提法最佳工藝提取條件是料液比為1:15，浸提溫度為95℃，浸提時(shí)間為3小時(shí)，得到枸杞多糖的得率為2.56%。該提取工藝條件，是一種提取成本低、枸杞多糖得率較高的方法，結(jié)果令人滿意。 關(guān)鍵詞：枸杞多糖，提取分離，含量測(cè)定 Abstract InordertostudytheextractionandseparationofChi

2、nesewolfberrypolysaccharidesinlyciumbettermethodandobtainedthehighestrateofcontent,inthispaper,onthebasisofsinglefactorexperiment,orthogonalexperimentdesign,intheChinesewolfberrypolysaccharideextractionprocessconditionswereoptimized,andtoobtaintheoptimizedparametersfortheamplification,ishotextractio

3、noptimumextractionconditionsweredeterminedandsolid-liquidratiois1:15,leachingtemperatureis95℃,leachingtimeis3hours,theyieldofLBPis2.56%,thepolysaccharidecontentofLBPwas43.35%.Itisamethodwithlowextractioncostandhighyieldoflyciumbarbarumpolysaccharide. Keywords：lyciumbarbarumpolysaccharide,Extracti

4、onandseparation,Contentdetermination  目錄 摘要 Ⅱ Abstract Ⅲ 1緒論 1 1.1研究背景 1 1.2枸杞多糖的簡(jiǎn)介 2 1.3多糖的提取分離方法 2 1.3.1多糖的提取方法 2 1.3.2多糖的分離方法 3 2實(shí)驗(yàn)部分 6 2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 6 2.1.1實(shí)驗(yàn)材料 6 2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 6 2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 6 2.2熱水浸提枸杞多糖 6 2.2.1提取工藝 6 2.2.2構(gòu)杞多糖中多糖含量測(cè)定方法 7 2．2.3熱水浸提枸杞多糖的研究 7 2.2.3.1單因素實(shí)

5、驗(yàn)的結(jié)果 7 2.2.3.2熱水浸提枸杞多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果 9 2.3本章小結(jié) 10 3研究結(jié)論 11 參考文獻(xiàn) 12 致謝 15 IV 1緒論 據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，枸杞的功效十分強(qiáng)大，一直以來就有枸杞可以補(bǔ)氣益血，清肝明目的效應(yīng)，也因此廣受人們關(guān)注。從古至今，以枸杞為養(yǎng)生食材的記載屢見不鮮，而就在最近的研究當(dāng)中，人們也發(fā)現(xiàn)，枸杞中的有效成分，如枸杞多糖、枸杞蛋白質(zhì)等對(duì)人體都具有很強(qiáng)的補(bǔ)充和修復(fù)作用，它們可以提高人體免疫力，進(jìn)一步抵抗疾病，延緩衰老。有部分研究人員認(rèn)為，提取枸杞多糖的方法數(shù)不勝數(shù)，本文就采用了其中幾種方法并分析其結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)，借以

6、為后來人提供新的參考思路與經(jīng)驗(yàn)。在1981-2010年期間，關(guān)于枸杞和枸杞多糖的新型治療劑就有八百七十六種，在這其中，天然產(chǎn)物和天然類似物與人工產(chǎn)物的比例幾乎已經(jīng)達(dá)到了1:1的程度。而對(duì)于天然產(chǎn)物的提取與分離，就是探究治療劑治療效果與研究難度的重點(diǎn)。 中藥產(chǎn)品常常成分復(fù)雜，根據(jù)現(xiàn)代精密儀器分析，常常可以達(dá)到成千上百種。其中也包含了各種天然產(chǎn)物。但有效的活性成分，往往只有其中的部分化合物。要想完全提取并明白天然產(chǎn)物的有效成分，就需要對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行分離與質(zhì)量分析控制。單糖與單糖結(jié)合、單糖與蛋白質(zhì)結(jié)合都可以構(gòu)成生物大分子，并廣泛存在于人體與自然界當(dāng)中，起到其至關(guān)重要的作用，如信息識(shí)別、能量傳遞、貯

7、存等。多糖的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，比如食品和保健品領(lǐng)域。 枸杞多糖的藥理和生物分子具有促進(jìn)身體健康的作用，醫(yī)療功效也非常不錯(cuò)，是一種相當(dāng)重要的生物活性物質(zhì)。近年來醫(yī)學(xué)界和營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的研究熱門，就是對(duì)多糖的探索研究。枸杞多糖的提取分離研究是一項(xiàng)頗有意義的工作，也是一項(xiàng)非常艱巨的工作。 1.1研究背景與研究目的 天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，含有多種生物活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、多糖、維生素、生物堿、揮發(fā)油、黃酮類化合物、糖苷和萜烯[1]?；钚源蠓肿优c小分子的分離比較容易，這其中大分子要想完全分離出來，并能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，就需要攻克其分離純化的技術(shù)難關(guān)。 關(guān)于多糖的提取，最重要的步驟就是得率與純度。提

8、高多糖的得率，不僅要優(yōu)化各種條件，還要需要保證多糖的生物活性不被破壞。水、酸溶液、堿溶液等，都是多糖提取的常用溶劑[2][3][4][5]. 因?yàn)闊崴@取成本低，多糖在熱水當(dāng)中的溶解度也較高，因此熱水就變成提取多糖時(shí)最重要的溶劑之一。但是由于部分多糖含有醛酸，因此，在提取這部分多糖時(shí)，就需要采用堿溶液。在目前的研究當(dāng)中，新的提取分離技術(shù)屢見不鮮，如西洋參多糖以超聲波輔助提取 [6]，大蒜油以超臨界CO2逆流萃取等[7],但是這些提取方法對(duì)設(shè)備等條件有很高的要求,其過程的復(fù)雜性也難以滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。部分研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖作為枸杞的有效成分之一，其效用十分廣泛，可以提高人體免疫力，延緩衰老，

9、并且有降低血脂的影響和抗衰老的作用[8][9]。并且有降低血脂的影響和抗衰老[8][9]。枸杞多糖產(chǎn)品現(xiàn)在粗多糖雜質(zhì)較多,水溶性清算解決方案有限程度是不夠的,所以不能滿足美國(guó)食品和藥物相關(guān)需求開發(fā)適當(dāng)?shù)男l(wèi)生保健產(chǎn)品和臨床應(yīng)用的藥物,所以未來的枸杞多糖提取天然植物藥的流程優(yōu)化,結(jié)構(gòu)特征分析是必要的,只有很好地了解了相應(yīng)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，才能為新藥和保健品的開發(fā)提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。 1.2枸杞多糖的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) 1.2.1枸杞多糖的結(jié)構(gòu) 枸杞多糖作為一種常見化合物，其分子量的測(cè)算、多糖的種類、腺苷鍵的數(shù)量、長(zhǎng)度、位置、異形、連接方式等等都在研究的范圍之內(nèi)。有學(xué)者在其研究著作中表明，枸杞

10、多糖實(shí)際上是由由1→3連接和1→6連接的3.33:53.55:39.35的阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖酸所組成。枸杞多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，骨架為1→3連接半乳糖，lblp5-a-oli為高度分枝多糖。在測(cè)量時(shí)采用阿蘭二（nl=0-6，n2=0-8，n3=0-1）來進(jìn)行分析。在測(cè)量前需要進(jìn)行柱分析來純化，進(jìn)一步得到二級(jí)組分與結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)分子當(dāng)中含有大量的氨基和氨基，它由五個(gè)單糖殘基組成。初級(jí)結(jié)構(gòu)由α-D-吡喃糖殘基組成。 1.2.2枸杞多糖的藥理功能 生殖系統(tǒng)保護(hù)功能: 中藥中常用枸杞治療不孕癥。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用枸杞多糖的抗氧化作用，就可以在一定程度上抑制自由基的裂變，抑制其致使細(xì)胞色素衰老的強(qiáng)制性表達(dá)和

11、H2O2酶的釋放，在一定程度上降低鼠睪丸細(xì)胞破裂和DNA的氧化，延長(zhǎng)小鼠精原上皮細(xì)胞熱損傷細(xì)胞的體外死亡時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)。枸杞多糖可以在一定程度上促進(jìn)?睪?丸?生?殖?細(xì)胞的發(fā)育，并促進(jìn)和調(diào)節(jié)下丘腦、下垂體的激素分泌。同時(shí)也能降低高溫和對(duì)精母細(xì)胞的損傷，受損的精原細(xì)胞染色體也受到保護(hù)作用。 抗氧化和抗衰老：在枸杞多糖的作用下，自由基的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)被多糖打斷并抑制，因此枸杞多糖可以起到抗氧化的作用。實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖還可以抑制H2O2酶的產(chǎn)生，表現(xiàn)出消除自由基、降低酶活性的作用。而且，其還原能力、清除能力也是枸杞多糖的拿手好戲。對(duì)游離過氧化氫對(duì)小鼠紅細(xì)胞溶血能力和鐵離子螯合能

12、力的抑制作用也有顯著表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中用輻射照射大鼠肝臟顆粒懸浮液或鈣多糖顆粒懸浮液，結(jié)果顯示，輻射引起的鈣蛋白損失被鈣多糖抑制，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶也被抑制，這種抑制關(guān)系呈現(xiàn)線性，比維E的影響更大。在部分研究當(dāng)中，多糖多數(shù)都由枸杞脫色、提水，然后再通過酒精萃取沉淀所獲得的大分子、總多糖化合物。羅瓊在其相關(guān)文獻(xiàn)中顯示：枸杞水提取物的體外抗氧化活性高于提水和酒精。近年，有學(xué)者已將提取多糖的蛋白質(zhì)水解，并以死亡瑪瑙的柱分離，得到中性多糖及三種酸性多糖等四種成分。比較了4種成分與非含酒精水提取物、透析治療多糖、脫蛋白溶多糖、粗多糖的抗氧化活性。在研究當(dāng)中，人們發(fā)現(xiàn)，這些蛋白（除去順式和DDP）都具有

13、去除自由基的功效，主要去除的自由基包括：2,2-亞氮-二-二(3-乙基-6-磺酸)自由基、超氧化物陰離子和羥基自由基的功能。 免疫調(diào)節(jié)作用：枸杞多糖可以起到免疫調(diào)節(jié)的作用，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，一般采用離子交換色譜法來探究其相對(duì)作用，通過柱實(shí)驗(yàn)的分離與探究，可以得到的是蛋白質(zhì)+多糖的結(jié)合，這種復(fù)合多糖具有一定程度的免疫刺激作用。實(shí)驗(yàn)表明，枸杞多糖在增加人外周血單核細(xì)胞I和TNF的表達(dá)方面都具有顯著作用，在該實(shí)驗(yàn)中，RNA與蛋白質(zhì)水平都與枸杞多糖呈現(xiàn)出顯著相關(guān)的劑量依賴性，從這個(gè)角度來說，枸杞多糖是可以增強(qiáng)免疫力的。鈣多糖的存在可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)增加一部分巨噬細(xì)胞的吞噬能力、分泌能力，從而影響RN

14、A的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)一步引起脂質(zhì)過氧化的減少，對(duì)生物體起到免疫調(diào)節(jié)的保護(hù)作用。有部分實(shí)驗(yàn)表明，枸杞多糖在調(diào)節(jié)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的表型和功能成熟度方面都都有顯著效應(yīng)。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)重要的抗原呈現(xiàn)細(xì)胞，在引發(fā)初期免疫反應(yīng)中起著獨(dú)到的作用。 抗腫瘤：一些研究人員發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可以起到抗腫瘤的效果，但是其作用機(jī)制尚不明確。有些學(xué)者認(rèn)為枸杞多糖之所以能夠抗腫瘤，是由于其激活的免疫體制，有些學(xué)者則認(rèn)為是通過增強(qiáng)人體自免疫，降低脂質(zhì)過氧化作用來達(dá)到抗腫瘤的效果。但是目前，這兩種說法都沒有可靠的證據(jù)來證明其觀點(diǎn)。也有人認(rèn)為，枸杞多糖之所以能夠抗腫瘤，是因?yàn)槠淇梢哉{(diào)節(jié)Ca+強(qiáng)度，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)有對(duì)肝癌細(xì)胞株的研究

15、。還有人認(rèn)為，枸杞多糖在某種程度上可以抑制細(xì)胞增殖，從而降低癌變速率，并在有絲分裂的S期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的功效。人體內(nèi)存在的鈣多糖還可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一點(diǎn)也在人前列腺癌當(dāng)中得到了證明。在細(xì)胞當(dāng)中，RNA量與Ca+的分布也有可能會(huì)抑制細(xì)胞系的生長(zhǎng)，與此同時(shí)劑量-時(shí)間反應(yīng)關(guān)系，這一關(guān)系的存在會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞DNA破裂和細(xì)胞的凋亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)表明，鈣多糖還可以在一定程度上抑制裸鼠的生理結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)習(xí)性。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖還可以誘發(fā)肝癌細(xì)胞癌變。 調(diào)節(jié)血脂和低血糖：吳等人在其相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)枸杞多糖的存在在非胰島素依賴型糖尿病大鼠的實(shí)驗(yàn)中可以顯著降低血糖水平，并進(jìn)一步提高血清當(dāng)中的

16、含量，從而減少外周淋巴細(xì)胞。在糖尿病家兔實(shí)驗(yàn)中，枸杞多糖可以顯著降低由四氧嘧啶誘導(dǎo)的血脂與血糖水平。據(jù)研究，枸杞多糖的作用劑量在20-50毫克，就可以對(duì)糖尿病患者起到一定程度的保護(hù)肝臟、腎臟等內(nèi)臟組織的作用，因此，我們可以說，枸杞是一種良好的有發(fā)展前景的調(diào)節(jié)血脂與低血糖物質(zhì)。 抗輻射：枸杞多糖在一定程度上能起到抗輻射的作用，可以促進(jìn)x射線和卡布鉑化療，然后進(jìn)一步誘導(dǎo)小鼠外周血液圖像的恢復(fù)，在這一基礎(chǔ)上，刺激人外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，重組粒細(xì)胞菌落刺激因子；輻射射線主要傷害的是小鼠肝細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)，多糖可減少這種損傷。它顯著地改善了線粒體糖蛋白的丟失，改善了由射線引起的肝細(xì)胞、過氧化氫酶和的失活。

17、它的抗輻射功能比生育酚更明顯。 保護(hù)神經(jīng)：香港大學(xué)的余等人發(fā)現(xiàn)，枸杞提取物通過抵抗神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激水平，在某種程度上都可以保護(hù)神經(jīng)，枸杞多糖可以對(duì)淀粉樣肽當(dāng)中存在的麻痹神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒性起到抑制作。所謂淀粉樣肽，是指阿爾茨海默氏病的病因之一，是引起它發(fā)病的關(guān)鍵因素。而枸杞多糖的存在，在抑制相對(duì)蛋白酶活性的基礎(chǔ)上，可以同時(shí)降低乳酸脫氫酶的活性，從而抑制c-垃圾氨基端激酶的磷酸化，起到阻止細(xì)胞凋亡，減緩細(xì)胞衰老與磷酸化的作用，進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。據(jù)推斷，這種保護(hù)作用可能會(huì)對(duì)阿爾茨海默氏病的治療與防護(hù)產(chǎn)生影響，為其提供新的思考方向。 抗癌作用：枸杞多糖可以對(duì)人胃腺癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞都起到較

18、為明顯的抑制作用，這是因?yàn)殍坭蕉嗵桥c癌細(xì)胞之間的聯(lián)合反應(yīng)。在臨床試驗(yàn)上，枸杞多糖治療原發(fā)性肝癌12例，初步判定，其可改善相對(duì)病因病狀，從而降低自免疫，延長(zhǎng)患者的壽命。實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖還可以升高抗腫瘤活性（小鼠實(shí)驗(yàn)）。 1.3多糖的提取分離方法 1.3.1多糖的提取方法 枸杞當(dāng)中的多糖，以不同形式存在或存在于不同提取部位都需要不同的預(yù)處理手法，目前常用的預(yù)處理手法主要包括脫色、粉碎、清洗、脫脂等。清洗最主要的目的是為了除去存在原料表面的灰塵、泥土等，而脫色則是為了減少多糖當(dāng)中原有的顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾與影響，而粉碎則是為了進(jìn)一步增加萃取時(shí)溶質(zhì)與溶劑的相對(duì)接觸面積，達(dá)到更強(qiáng)的萃取效果，

19、脫脂則是為了去除存在植物細(xì)胞當(dāng)中的部分脂質(zhì)，減少對(duì)后續(xù)研究和分析的影響，使多糖更有可能被釋放。多糖的提取方法有溶劑萃取法、酶解萃取法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取法等。 （1） 溶劑浸提法[10]：多糖易溶于水，所以在提取多糖時(shí)刻采用水性溶劑，比如純水、酸、堿，或者有機(jī)溶劑如乙醇、甲醇等。多糖易溶于水，尤其是熱水，而且熱水來源廣泛，造價(jià)低廉，因此，用熱水作為提取溶劑的方法最為普遍。酸堿溶液由于其腐蝕性高，可以破壞植物細(xì)胞壁，進(jìn)而增加多糖的溶解度，但是與此同時(shí)，高腐蝕性的酸堿溶液也容易溶解糖苷鍵，破壞多糖的三維立體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步改變其活性。因此，在實(shí)際操作中幾乎很少有人會(huì)用到酸

20、堿溶液。 （2）內(nèi)部沸騰法：內(nèi)部沸騰法主要是利用熱效應(yīng)，在加入外熱溶劑的基礎(chǔ)上產(chǎn)生熱量，從而加速萃取，加大萃取效率。 （3)酶解提取法：生物酶是細(xì)胞中一種特殊的蛋白質(zhì)，可以參與活細(xì)胞中的各種反應(yīng)。酶萃取法的優(yōu)點(diǎn)是酶具有特異性和催化作用，在溫和的條件下可以破壞植物的組織結(jié)構(gòu)，釋放多糖。缺點(diǎn)是酶容易失活，成本高。常用的酶包括纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶。 （4）超聲波輔助提取法：利用超聲作用產(chǎn)生的高頻振動(dòng)效應(yīng)，加速細(xì)胞破裂及內(nèi)部物質(zhì)的釋放溶解，可提高提取效率[11][12]。 （5）微波輔助提取法：利用高溫破裂細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)容物流出，加速萃取，加大效率。 （6)超臨界流體萃取法：就是利用超

21、臨界流體（CO2、水、乙烯），從固相或液相當(dāng)中萃取特定成分，使提取物與萃取劑分離。但是要注意的是，多糖作為高極性有機(jī)化合物，不能采用超臨界CO2來提取。添加適當(dāng)?shù)恼澈蟿┛商岣咂溥x擇性和溶解性。 1.3.2多糖的分離方法 常見的多糖分離方法可以將多糖當(dāng)中的其他雜質(zhì)，如蛋白、色素、無機(jī)鹽、有機(jī)分子等分離除去，一般來說可以使用離子交換柱色譜法、透析法、凝膠超濾法等。 （１）洗脫蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)與細(xì)胞多糖結(jié)合就會(huì)形成結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、功能較為完善的其他多糖。但是蛋白質(zhì)的提取與洗脫就成為技術(shù)上需要攻克的難點(diǎn)，蛋白質(zhì)可溶于水相溶劑，但是不溶于醇。因此，不能采用水萃取酒精沉淀法。在提取時(shí)，常用的方法有很

22、多：a. sevag法，利用蛋白質(zhì)變性的特質(zhì)，在有機(jī)溶劑中洗脫蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)試劑采用的是25：5:1的多糖：氯仿：正丁醇。sevag法的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)過程較為溫和，不會(huì)損傷相應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)，但是與此同時(shí)，也需要多次洗脫，才能真正去除蛋白質(zhì)。b.三氯乙酸法。就是將1：1的三氯乙酸與多糖混合后充分?jǐn)嚢璨㈦x心，然后丟棄已經(jīng)變性的絮狀蛋白。該方法的優(yōu)點(diǎn)是去除洗脫效率較高，但是有一定的可能會(huì)破壞多糖，尤其是含有呋喃糖基的結(jié)構(gòu)。c.三氟三氯乙烷法。該方法就是將一定量的多糖加入三氟三氯乙烷，然后攪拌并離心，然后篩選出相對(duì)應(yīng)的已變性的絮狀蛋白。該方法的特點(diǎn)在于去除率較高，但是與此同時(shí)，也會(huì)造成溶劑的揮發(fā)與浪費(fèi)，因此

23、該方法用途并不是很廣泛。d.酶法。該方法是在多糖和蛋白質(zhì)大分子當(dāng)中加入一定量的蛋白酶，用以水解蛋白質(zhì)。該方法的特點(diǎn)是溫和且高效 [13][14]。 （2）脫色：所謂的脫色，就是從植物當(dāng)中去除部分含有色素的酚類物質(zhì)。色素顏色較深時(shí)會(huì)對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，因此，需要進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)。一般來說，常用的脫色方法有：a.物理吸附法，即采用活性炭等吸附劑，吸附干擾色素。該方法溫和，價(jià)格低廉，但是脫色效率較低，因此一般不用于多糖脫色。b.化學(xué)反應(yīng)法。常用的化學(xué)脫色劑包括H2O2等，可以通過與色素反應(yīng)而達(dá)到脫色的目的，但是化學(xué)反應(yīng)法的反應(yīng)終點(diǎn)仍在溶液當(dāng)中，因此會(huì)影響其活性。c.離子交換柱法。常用的離子交換柱包括

24、脫纖維素交換柱等，這種離子柱不僅可以脫色多糖，同時(shí)還可以給多糖進(jìn)行分類[15]。 (3)分級(jí)：所謂分級(jí)，就是經(jīng)過上述脫蛋白和脫色處理后，將含有多種成將含有多種成分的多糖分級(jí)并處理，因?yàn)樗麄兯械膯翁桥c單糖組成、聚合方法都有較強(qiáng)的差異。其常用的分級(jí)方法有a.級(jí)分沉淀法[16]，就是采用多級(jí)沉淀的方法，根據(jù)多糖的不同分子量來進(jìn)行順序分離。b.離子交換色譜法[17]：其原理就是根據(jù)多糖所帶有的電荷量不同來進(jìn)行分級(jí)，即將離子交換器電與電荷結(jié)合，或者通過分子篩來進(jìn)行分離與預(yù)處理。常見的色譜柱有凝膠柱色譜[18]等，這些色譜柱用途廣泛，常用于常用于瓊脂凝膠、葡聚糖凝膠，但是由于離子柱多半價(jià)格高昂，只適

25、用于處理實(shí)驗(yàn)室分級(jí)，不太適用于實(shí)踐應(yīng)用。c.其他，比如超濾分離法[19]，這種方法可以分離多糖，就是通過不同的分子量與電荷量來進(jìn)行分離，除此之外，還包括金屬法、鹽分析法等分析手段。  2實(shí)驗(yàn)部分 2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 2.1.1實(shí)驗(yàn)材料 寧夏枸杞干果300g 2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖500ml，氯仿500ml，甲醇2000ml，苯酚2000ml，濃硫酸200ml，純凈水2000ml。 2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 2.2熱水浸提枸杞多糖 2.2.1提取工藝 將其碎為粉末，準(zhǔn)確稱為10g枸杞多糖粉末，加入氯仿和甲醇溶液加熱回流做實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。將產(chǎn)生的濾渣加入85%的乙醇溶液中加熱

26、回流，丟棄濾渣，用一定量的純水過濾淹沒。改變熱水提取條件（在不同的浸出率、不同的浸出溫度和不同的浸出時(shí)間比較下），進(jìn)行單因素試驗(yàn)，離心后收集上部過濾[20]。該過濾器使用塞瓦格方法去除蛋白質(zhì)[21][22]，減壓濃縮到約45毫升，并增加4.5倍的乙醇體積。生成的沉淀用乙醇和丙酮依次清洗，在冷凍干燥后24小時(shí)就可以得到多糖質(zhì)量。重量，計(jì)算來速率。這樣就能測(cè)定了枸杞多糖的多糖含量，確定了影響因素的范圍和各因素的最佳條件。根據(jù)以上結(jié)果設(shè)計(jì)和測(cè)試正交試驗(yàn)。確定提取的最佳條件。 2.2.2構(gòu)杞多糖中波長(zhǎng)的選擇及多糖含量測(cè)定方法 2.2.2.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 表2-3波長(zhǎng)與吸光度 波長(zhǎng)/nm

27、 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 吸光度 0.11 0.39 0.86 1.35 1.56 1.76 1.49 0.73 0.43 0.21 0.13 2.2.2.2枸杞多糖含量測(cè)定方法 (1) 使用苯酚硫酸[23][24][25]測(cè)定，即以多糖的水解為原理，以硫酸為催化劑，脫水生成乙醇醛衍生物，然后再與苯酚反應(yīng)，形成淡黃色化合物，通過比色法進(jìn)行測(cè)定。其在一定的濃度范圍之內(nèi)，吸收值與枸杞多糖的含量會(huì)呈一種線性相關(guān)關(guān)系的關(guān)系圖，因此多糖的濃度可以也就是說從吸收值的大小可以計(jì)算出來多糖的重量

28、，那么就可以計(jì)算出來枸杞多糖在枸杞中的含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確地稱為無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)100mg至100ml容量瓶，定尺水容量，準(zhǔn)確地?cái)z取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)10mg至100ml容量瓶，設(shè)定水容量，并準(zhǔn)備100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液來提供使用。 （2） 苯酚溶液的制備：分析純酚在65℃水浴中的熱溶解，稱175克，再加上鋁片0.1克和碳酸氫鈉0.05克，普通壓力蒸餾，收集180℃的餾分，這一餾分取45克，加入10克純水，放入50毫升的棕色瓶中，并把配置好的溶液儲(chǔ)存在4℃的冰箱中，冷凍保存，使其生物的活性不變性。 （3）繪制溶液標(biāo)準(zhǔn)的曲線。對(duì)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行0.2、0.4、0.6、0.8、

29、1.0毫升的精密測(cè)量，將其放置在插入式試管中，分別加水至1毫升。每一精確度加入1.0mLl5%的酚溶液（準(zhǔn)備暫時(shí)使用）搖勻，用5mL濃硫酸緩慢慢滴入到苯酚溶液，均勻搖勻，然后在75°C的恒溫下沐浴35分鐘，除去，快速冷卻至室溫，并以水來為空白。在540nm的波緣測(cè)量處的吸光度，以取吸光度為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)是配置溶液濃度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （4）測(cè)定多糖的樣品含量：稱量100毫克多糖樣品，水容量固定為100ml，精密測(cè)量為10mL至 100mL容量瓶，用水稀釋至刻度線處，搖勻均勻，精密測(cè)量為1mL，精確度1mL5%的苯酚溶液，均勻晃動(dòng)，慢慢滴入5ml濃硫酸，75分鐘熱水浴后均勻晃動(dòng)，去除，迅速冷卻

30、至室溫，水為空白，測(cè)量540nm波緣的光吸收，用同一方法平行測(cè)量3次。通過將測(cè)量到的吸收率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，計(jì)算多糖樣品含量。 2．2.3熱水浸提枸杞多糖的研究 2.2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 單因素實(shí)驗(yàn)，探究枸杞多糖的浸出液的比例、溫度與時(shí)間三個(gè)因子。結(jié)果如圖1-3所示。 單因素試驗(yàn)條件：如圖1，溫度95°C，時(shí)間3小時(shí)。溶液劑量增加會(huì)影響多糖產(chǎn)量，并使其進(jìn)一步增加，最后達(dá)到平衡。原理即是隨著溶液劑量的增加，會(huì)稀釋多糖，使?jié)舛冉档停M(jìn)一步有利于多糖的傳導(dǎo)運(yùn)輸過程。但是，溶解劑量過大，隨后的濃度步處理時(shí)間增加，能耗就會(huì)相應(yīng)增加。因此，在1:15、1:20和1:25的比例上

31、進(jìn)行了正交試驗(yàn)。 圖1浸提料液比與構(gòu)杞多糖提取得率的關(guān)系 浸沒溫度的單因素試驗(yàn)條件為1：20，浸沒時(shí)間為3小時(shí)。結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，隨著浸出溫度的慢慢升高，多糖的產(chǎn)率也會(huì)不斷得上升，最終慢慢的變得穩(wěn)定下來。從這實(shí)驗(yàn)表明，溫度的升高可以增加多糖的浸出量。這是因?yàn)楦邷靥岣吡硕嗵堑膫鲗?dǎo)運(yùn)輸?shù)盟俾?。從另一面來考慮，它增加了多糖在溶劑中的溶解度得大小。傳統(tǒng)的水浴設(shè)備，通常最高溫度一般只能達(dá)到95℃，不能達(dá)到更好的溫度條件。因此選擇70℃、80°℃、95℃這三種溫度水平來進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)量其浸出率。 圖2浸提溫度與構(gòu)杞多糖提取得率的關(guān)系 浸出時(shí)間的單因素試驗(yàn)條件為：浸

32、出液比為1:20，浸出溫度為95°c。結(jié)果見圖3。圖3顯示，枸杞提取率會(huì)隨著浸出時(shí)間的增加，多糖得質(zhì)量首先要增加。當(dāng)時(shí)間超過3小時(shí)以后，多糖產(chǎn)率慢慢的就會(huì)平穩(wěn)下來。因此，選擇2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)的提取時(shí)間來做進(jìn)行正交試驗(yàn)，可以更好地觀察其多糖得率。 圖3浸提時(shí)間與構(gòu)杞多糖提取得率的關(guān)系 2.2.3.2熱水浸提枸杞多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果 研究多因素實(shí)驗(yàn)共同作用的設(shè)計(jì)方法稱為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，它層層遞進(jìn)，可以較好把握實(shí)驗(yàn)進(jìn)程與多因素，最后使實(shí)驗(yàn)達(dá)到平衡，因此，可以選取一定的元素，盡可能得較少進(jìn)行試驗(yàn)，但是也尋找較好的試驗(yàn)條件。這樣既可能大大的節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，也能節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材達(dá)到減少實(shí)驗(yàn)成本的

33、母的。本實(shí)驗(yàn)以枸杞多糖的產(chǎn)量為指標(biāo)，選擇L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體試驗(yàn)條件見表1，經(jīng)過方差分析，從而確定最佳工藝條件，判斷枸杞多糖的對(duì)應(yīng)提取目的，判斷方法。 表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表 本文如表1所示的因素和水平，設(shè)計(jì)了9套測(cè)試條件。對(duì)每組10克干果粉進(jìn)行了精確的測(cè)定，并按2.2.3.1提取工藝提取。以多糖產(chǎn)量為主要檢測(cè)指標(biāo)。計(jì)算結(jié)果就見表2。 表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 編號(hào) 料液比（m/v） 浸提溫度/℃ 浸提時(shí)間/h 多糖得率% 1 1 1 1 1.56 2 1 2 2 2.14 3 1 3 3 2.70 4 2 1

34、 2 1.84 5 2 2 1 2.29 6 2 3 1 2.48 7 3 1 3 2.08 8 3 2 1 2.19 9 3 3 2 2.58 根據(jù)表1和表2，不同因素對(duì)枸杞多糖產(chǎn)量的影響主要表現(xiàn)在提取液的溫度、時(shí)間和配比。即浸出溫度是影響多糖產(chǎn)量的主要因素。隨著溫度的升高，多糖的產(chǎn)率提高，以95℃作為浸出溫度。其中，提取時(shí)間（T）作為次要因素影響多糖提取率。但是隨著T的推移，多糖也逐漸增加，最后達(dá)到穩(wěn)定。由實(shí)驗(yàn)過程可以判斷出大約需要3小時(shí)，因此，3h就是最佳提取時(shí)間。據(jù)結(jié)果，溫度、提取時(shí)間都是影響因素，其中溫度的影響更為重要。故得到最

35、佳條件：液體比1:15，浸出溫度為95℃，浸出時(shí)間為3h。 方差分析表 變異來源 偏差平方和 自由度 均方 F值 料液比 0.036 2 0.018 2.105 溫度 0.845 2 0.423 49.175 時(shí)間 0.117 2 0.059 6.828 誤差 0.017 2 0.009 2.3討論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T（溫度）與t（時(shí)間）都是該實(shí)驗(yàn)的影響因子，除去提取溫度外，提取時(shí)間、物質(zhì)與液體的比例關(guān)系都會(huì)對(duì)多糖產(chǎn)率產(chǎn)生影響，其中，最佳提取條件為1:15。浸出溫度為95℃，浸出時(shí)間為3小時(shí)。此時(shí)，枸杞多糖產(chǎn)量為2.56%。 

36、3研究結(jié)論與展望 3.1研究結(jié)論 將枸杞作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)一步比較了枸杞中多糖含量分析的不同方法，并優(yōu)化了影響枸杞中多糖的多種提取因素。單因素實(shí)驗(yàn)作為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，然后進(jìn)一步設(shè)計(jì)了多種正交試驗(yàn)，優(yōu)化多糖提取因素的基礎(chǔ)上，也優(yōu)化了相應(yīng)的試驗(yàn)方法，并對(duì)得到的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了擴(kuò)展與校正。測(cè)定熱浸泡配方的最佳方法是得到比例就為1:15，浸泡溫度為95℃，浸泡時(shí)間為3小時(shí)，從枸杞中提取的多糖產(chǎn)率為2.56%。 3.2展望 雖然實(shí)驗(yàn)取得了一些成績(jī)，但仍有許多不足之處有待進(jìn)一步補(bǔ)充或研究。主要包括以下幾點(diǎn)： （1）對(duì)枸杞多糖的提取方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，但枸杞中還有許多其他活性物質(zhì)，造成較大的浪費(fèi)。如何優(yōu)化枸

37、杞的整體提取方法，提取盡可能多的有效成分。仍然需要進(jìn)一步研究，則需要在接下來的實(shí)驗(yàn)研究中，多多嘗試新的方法。 （2）對(duì)枸杞多糖的質(zhì)量鑒定進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，但對(duì)天然產(chǎn)品質(zhì)量控制的其他方面也需要嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。例如，可以將原材料、生產(chǎn)技術(shù)、最終產(chǎn)品以及分析和測(cè)試方法納入未來的研究范圍。 （3）但是本文的研究存在的問題依然有很多，比如沒有采用超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法，在枸杞多糖的分離提取中仍然有很多的問題，希望今后大家在枸杞多糖提取分離的實(shí)驗(yàn)以及研究中，可以將枸杞多糖的活性成分以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究并開發(fā)利用，造福于人類。 參考文獻(xiàn) [1]阮沖，肖小華，李攻科．天然產(chǎn)物有效成分提取分離制備

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