臨床檢測(cè)樣本RNA提取方法的比較研究生物技術(shù)專業(yè)

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1、 臨床檢測(cè)樣本 RNA 提取方法的比較研究 摘要：選擇市售的三種細(xì)胞裂解液（Liaison Plus、Troll Plus 和RNAOUT）和兩種 DNA\RNA共提試劑盒（柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒），分別對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和乙型腦炎病毒（JEV）三種病毒 RNA 進(jìn)行提取，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和 Real-time PCR 間接評(píng)價(jià)所提取的 RNA 質(zhì)量。結(jié)果表明：對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，上述三種細(xì)胞裂解液和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組均可見(jiàn)清晰且高亮的條帶，

2、可用于臨床 RNA 病毒檢測(cè)以及定性分析。對(duì)于Real-time PCR，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒 CT 值最低，Liaison Plus、Troll Plus 兩種細(xì)胞裂解液其次，以上三種試劑可用于臨床 RNA 病毒檢測(cè)以及定量分析。 關(guān)鍵詞：RNA；提取方法；比較；臨床 Comparison of Methods of clinical test samples RNA extraction Abstract：Three commercially available cell sates (Liaison Plus, Troll Plus and RNAOU

3、T) and two DNA / RNA co-kits (ALCMENA double-kit, Queasy rapid DNA / RNA co-kit) were selected to extract three animal RNA viruses（PRRSV, CSFV and JEV）. The RNA quality was evaluated indirectly by agaric gel electroplate and Real-time PCR. The result shows, for agaric gel electroplate, the clearly

4、 and highlight bands can be seen above the groups of the three cell sates and Queasy rapid DNA / RNA co-kit, which can be used for clinical RNA virus detection and qualitative analysis. For Real-time PCR, the CT value of the Queasy rapid DNA / RNA co-kit group is the lowest, and the two cell sates g

5、roups(Liaison Plus, Troll Plus) followed. The above three reagents can be used for clinical RNA virus detection and quantitative analysis. Key words: RNA；Extraction Method；Comparison；Clinical RNA 是生物體重要的遺傳物質(zhì)[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的科研結(jié)果表明，RNA 在生命進(jìn)程中的作用遠(yuǎn)不止于此，在 2002 年度 Science 評(píng)選的 10 大科學(xué)成就中 RNA 名列榜首。 RNA 分子

6、提取是生物學(xué)研究中的一項(xiàng)基本內(nèi)容，是進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)[2]。對(duì)于 DNA 文庫(kù)構(gòu)建、熒光定量 PCR、CRT、Northern 雜交等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，都需要質(zhì)量好的，完整性高的 RNA[3]。 在所有 RNA 試驗(yàn)中最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng) RNA。分離出純度高且完整的 RNA 是進(jìn)行基因表達(dá)分析及 RNA 結(jié)構(gòu)功能研究的基礎(chǔ)。在所有 RNA 實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的步驟是分離得到純度高且完整的 RNA。，從組織細(xì)胞中分離純粹完整的 RNA 對(duì)于分子克隆和基因表達(dá)分析等試驗(yàn)是至關(guān)重要的[4,5] Chomsky 和 Sac chi 第一次提出了用異硫氰酸胍法提取細(xì)胞內(nèi)的 RNA

7、[6]， 使得 RNA 的提取過(guò)程變得簡(jiǎn)便快捷。常見(jiàn)的 RNA 提取方法有強(qiáng)變性劑法[7]、CTAB 法[8]、ADS-Phenol 法[9]以及熱硼酸法[10]等。在商品化的今天，國(guó)內(nèi)外生物試劑公司研發(fā)出了許多 RNA 提取試劑盒。比如 Tamara 公司的 Liaison Plus； Inviting 公司的 Tripoli 總 RNA 提取試劑盒以及 Pure Link? RNA Mini Kit；上海生工的 UNlQ-10 柱式 Tripoli 總 RNA 抽提試劑盒；Omega 公司的 RNA 小量提取試劑盒（Bacteria RNA kit）以及高純 RNA 抽提試劑盒（HP

8、 total RNA kit）； Engage 公司的 RN easy Protect Bacteria Mini and Midi Kits 等。都可以從病料組織或者培養(yǎng)細(xì)胞中快速有效地提取出高質(zhì)量高純度的 RNA。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)[11,12]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當(dāng)一個(gè)熒光分子（供體分子）的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時(shí)，供體熒光分 子自身的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Ct 值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct 值是實(shí)時(shí)熒光 PCR 中一個(gè)很關(guān)鍵的因素，C 代表循環(huán)（Cycl

9、e）， t 代表閾值（Threshold）。每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-15]。因此，根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與 PCR 產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行“實(shí)時(shí)”檢測(cè)并獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通 PCR 相比，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 可以利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化， 可以對(duì)初始模板量進(jìn)行定量分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的基本原理就是樣本核酸擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，在反應(yīng)體系

10、和條件完全一致的情況下，樣本 DNA 含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物（熒光探針）與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因此通過(guò)熒光量的檢測(cè)就可以測(cè)定樣本核酸量[16-18]。 大量的研究實(shí)驗(yàn)證明：雖然提取 RNA 的方法很多，但是其基本都是把細(xì)胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白質(zhì)、DNA 等雜質(zhì)為目標(biāo)。而且材料自身物理化學(xué)性質(zhì)的不同，不同的材料需要不同的提取方法［19 ,20］。因此，需要通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，針對(duì)不同細(xì)胞組織，選擇更加合適的 RNA 提取方法。 1 材料與方法 1.1 試劑 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株，中

11、牧實(shí)業(yè)股份有限公司），豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗（成都天邦生物制品有限公司，），日本乙型腦炎弱毒活疫苗 （SA14-14-2 株），Troll Plus 總 RNA 提取試劑（南京天為生物科技有限公司），動(dòng)物 RNAOUT（北京天恩澤基因科技有限公司），Liaison Plus（寶生物工程有限公司），柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒（上?？祆`生物科技有限公司），氯仿（），乙醇（），異丙醇（上海申博化工有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（），Mixture（） 1.2 總 RNA 提取 1.2.1 細(xì)胞裂解液法提取

12、RNA (1) Liaison Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μL，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入

13、 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 （2） RNAOUT 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μ

14、L，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 （3） Troll Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL

15、 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μL，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 1.2.2 柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 離心管中加入 100μL 疫苗稀釋液，加入 600μL 溶液 A

16、，振蕩 30s 混勻后室溫放置 10min（溶液 A 在 4℃放置后可能產(chǎn)生沉淀，使用前必須放入 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用）；短暫離心后，將 500μL 溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置 2min；12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的的穿透液，把離心柱放回到收集管中；將剩余的溶液短暫離心后全部轉(zhuǎn)移到上一步的離心柱中，室溫放置 2min；12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的的穿透液，把離心 柱放回到收集管中；加入 700μL 的通用洗柱液到離心吸附柱中，12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的穿透液，把離心柱放回到收集管中；12000

17、rpm 室溫離心 1min（干甩），棄含穿透液的離心管；將干甩后的離心吸附柱套入到一個(gè)自備的 Freebase 的 1.5mL 離心管中，在離心吸附柱的中心加入 30—40μL 的洗脫液，然后室溫放置 2min；12000rpm 離心 1min，離心管中為 RNA 溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 1.2.3 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 了離心管中加入 100μL 處理好的樣本液，然后加入 300μL 核酸提取液，振蕩混勻，室溫靜置 2—3min；加入 400μL

18、 異丙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 5min，棄凈溶液；加入 600μL 50%異丙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 1min，棄凈溶液； 加入 600μL 75%乙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 1min，棄凈溶液；離心管短暫離心 5—10s 后，用 10μL 槍頭棄凈溶液，若管底出現(xiàn)少量沉淀，可開(kāi)蓋室溫干燥2—3min；加入 10—30uL 洗脫液，振蕩混勻后短暫離心，置于-80℃保存?zhèn)溆?。其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 1.3 RNA 質(zhì)量檢測(cè) 1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 分別取 RNA 樣品 6μL，加入

19、Ac Curt Reaction Mix（4X）2μL，混勻后室溫放置 2min；加入 Ac Curt Reaction Shoppe（r 5X）2μL，5X All-in-One RT Choirmaster 4μL， Antinuclear H2O 6μL，總體系為 20μL 進(jìn)行 CRT（25℃ 10min，42℃ 50min， 85℃ 5min）。將反應(yīng)生成的 DNA 分別用于普通 PCR，分別取 RNA 4—5 μL，在 1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，85 V 恒壓 25 min。紫外燈下照射觀察條帶，并拍照記錄結(jié)果。 其中，RNA 樣品有三種（PRRSV、CSFV

20、 和 JEV），每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 1.3.2 Real-time PCR 分別取 RNA 樣品 6μL，加入 Ac Curt Reaction Mix（4X）2μL，混勻后室溫放置 2min；加入 Ac Curt Reaction Shoppe（r 5X）2μL，5X All-in-One RT Choirmaster 4μL， Antinuclear H2O 6μL，總體系為 20μL 進(jìn)行 CRT（25℃ 10min，42℃ 15min， 85℃ 5min）。 其中，RNA 樣品有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。而后配置 Real-time

21、 PCR 體系，如下： 體系： SYBR Premix EX Ta Ⅱ（2x）： 10 AL PCR Forward Primer： 0.6 AL PCR Reverse Primer： 0.6 AL DNA 模板 2 AL 三蒸水 6.8 AL 總 20 AL 兩步法 PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序： Stage1：預(yù)變性Reps：1 95℃ 30 秒 Stage2：PCR 反應(yīng) Reps：40 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-time PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，按照內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增結(jié)果，應(yīng)用 2ΔΔCT 的方法技術(shù)最終的 CT 值；

22、評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，間接評(píng)價(jià)核酸的提取效果。 上述反應(yīng)應(yīng)用 ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（美國(guó) Applied Bio systems 公司）進(jìn)行。其中，每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。 2.結(jié)果 2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 2.1.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株）檢測(cè)結(jié)果 從圖 1 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組，電泳條帶亮度和清晰度很高，彼此之間無(wú)肉眼可見(jiàn)差距；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 1 PRRS

23、V DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對(duì)照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng)Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.1.2 豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗檢測(cè)結(jié)果 從圖 2 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組，電泳條帶亮度和清晰度很高。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度

24、最高；Liaison Plus 和 RNAOUT 對(duì)應(yīng)的組條帶中度清晰、亮度中等，但兩組之間無(wú)肉眼可見(jiàn)差距； Troll Plus 對(duì)應(yīng)的組清晰度較低，亮度低；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 2 CSFV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對(duì)照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng)Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.1.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測(cè)

25、結(jié)果 從圖 3 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組之間，電泳條帶亮度和清晰度很高。其中， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高；Liaison Plus 和 RNAOUT 對(duì)應(yīng)的組條帶中度清晰、亮度中等，但兩組之間無(wú)肉眼可見(jiàn)差距；Troll Plus 對(duì)應(yīng)的組清晰度較低，亮度低；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 3 JEV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對(duì)照，1-3、4-6

26、、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 2.2.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株）檢測(cè)結(jié)果 從圖 4 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組

27、CT 值最低；Liaison Plus 和RNAOUT 對(duì)應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 對(duì)應(yīng)的組 CT 值稍高；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最高。 圖 4 PRRSV Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對(duì)應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2.2 豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗檢測(cè)結(jié)果 從圖 5 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Pl

28、us、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最低；Liaison Plus 和 RNAOUT 對(duì)應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 和柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值稍最高，但兩組間差距不明顯。 圖 5 CSFV Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對(duì)應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DH

29、ARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測(cè)結(jié)果 從圖 6 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最低；Liaison Plus 和 RNAOUT 對(duì)應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 對(duì)應(yīng)的組 CT 值稍高；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最高。 圖 6

30、JEV Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對(duì)應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 3 討論 RNA 的提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)[21]，如何提取從動(dòng)物細(xì)胞和組織中提取高質(zhì)量的 RNA 更是科研研究和病原診斷的關(guān)鍵。只有獲得高純度、高濃度和完整性好的 RNA 才能更好的進(jìn)行下游反應(yīng)，如 DNA 文庫(kù)構(gòu)建、熒光定量 PCR、CRT、 Northern 雜交等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 RNA 的提取關(guān)鍵在于組織細(xì)胞裂解。組織

31、裂解方法有很多，包括胍鹽裂解法、堿裂解法、CTAB 裂解法和酚油抽提法等，這類方法雖然具有提取高純度核酸的優(yōu)點(diǎn)，但是普遍存在實(shí)驗(yàn)步驟多、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)以及部分存在毒性等缺點(diǎn)[22]。隨著生物產(chǎn)業(yè)的商業(yè)化發(fā)展，很多試劑公司根據(jù)組織裂解的方法設(shè)計(jì)出了很多商品化試劑，比如 Tamara 公司的 Liaison Plus、天為生物科技有限公司的 Troll Plus，天恩澤基因科技有限公司的動(dòng)物 RNAOUT 等。這些試劑可以從動(dòng)物組織、培養(yǎng)細(xì)胞和微生物中簡(jiǎn)單、快速的提取 RNA，且獲得的 RNA 完整性好，純度高操作過(guò)程簡(jiǎn)單，并且毒性小，實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性小。 通常情況下，分子生物學(xué)試驗(yàn)只需單獨(dú)提取一

32、種類型的核酸（DNA/RNA）或蛋白質(zhì)。如果想要同時(shí)獲得 DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)，則需要分別提取。顯然這種方式效率不高，因此，隨著科技的進(jìn)步，出現(xiàn)了很多商品化試劑盒，如天恩澤基因科技有限公司的柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法、快靈生物科技有限公司的 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒等。此類方法操作起來(lái)簡(jiǎn)便，時(shí)間短，可以同時(shí)提取 DNA 和 RNA，毒性小，且獲得的核酸完整性好，純度高等。 筆者所在實(shí)驗(yàn)室選取了市售的三種細(xì)胞裂解液（Liaison Plus、Troll Plus 和 RNAOUT）和兩種 DNA\RNA 共提試劑盒（柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、

33、 Queasy 快速DNA/RNA 共提試劑盒）。分別對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和乙型腦炎病毒（JEV）三種疫苗毒的 RNA 進(jìn)行提取，而后進(jìn)行 CRT 將所提取的 RNA 轉(zhuǎn)換成 DNA，分別用于普通 PCR 并進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳和 Real-time PCR，之后分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰度、亮度和Real-time PCR CT 值來(lái)間接對(duì)所提取 RNA 質(zhì)量作評(píng)價(jià)和比較。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，對(duì)于 PRRSV，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對(duì)應(yīng)的組均可見(jiàn)清

34、晰度高，亮度高的條帶，表明對(duì)應(yīng) DNA 質(zhì)量好，間接表明所提取的 RNA 質(zhì)量好。因此，上述試劑可用于臨床 PRRSV 的病毒檢測(cè)以及定性分析。對(duì)于 CSFV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高，其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，Troll Plus 稍差。因此，對(duì)于臨床 CSFV 的病毒檢測(cè)以及定性分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對(duì)于 JEV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高， 其次是 Liaison Plus

35、 和 RNAOUT，Troll Plus 稍差。因此，對(duì)于臨床 JEV 的病毒檢測(cè)以及定性分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 Real-time PCR 結(jié)果表明，對(duì)于 PRRSV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最低，表明對(duì)應(yīng)的 DNA 濃度和純度最好，間接說(shuō)明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此，對(duì)于臨床 PRRSV 的病毒檢測(cè)以及定量分析， 首選 Queasy 快速

36、DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和RNAOUT。對(duì)于 CSFV， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最低，表明對(duì)應(yīng)的 DNA 濃 度和純度最好，間接說(shuō)明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此， 對(duì)于臨床 CSFV 的病毒檢測(cè)以及定量分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對(duì)于 JEV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組 CT 值最

37、低，表明對(duì)應(yīng)的 DNA 濃度和純度最好，間接說(shuō)明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此，對(duì)于臨床 JEV 的病毒檢測(cè)以及定量分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 本次實(shí)驗(yàn)僅僅對(duì) PRRSV，CSFV 和 JEV 三種 RNA 病毒的疫苗毒 RNA 進(jìn)行提取比較。以上三種病毒均為臨床常見(jiàn)的 RNA 病毒，具有代表性。通過(guò)比較分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為當(dāng)臨床需要對(duì) PRRSV，CSFV 和 JEV 三種 RNA 病

38、毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒和 Liaison Plus 和 RNAOUT 兩種細(xì)胞裂解液，獲得的 RNA 質(zhì)量好，利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，市面上已經(jīng)出現(xiàn)自動(dòng)核酸提取儀，如 ABI 公司的 ABI PRISMTM 6100 核酸提取儀，半個(gè)小時(shí)即可完成 96 個(gè)樣品的純化工作，并且可純化來(lái)自多種生物樣本的總 RNA 和基因組 DNA[23]。隨著科技的發(fā)展，類似的儀器也在不斷出現(xiàn)和升級(jí)，但由于成本較高，且有時(shí)并不需要同時(shí)提取 96 個(gè)樣本，因此多數(shù)高校和科研機(jī)構(gòu)并未普及。 每種 RNA 提取方法均有其各自的優(yōu)勢(shì)，如何選擇合適的 RN

39、A 提取方法應(yīng)根據(jù)提取對(duì)象、所需濃度和數(shù)量、時(shí)間以及純度等來(lái)綜合選擇。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步， 相信動(dòng)物組織 RNA 提取的方法會(huì)越來(lái)越簡(jiǎn)便、快速、高效。 致謝 參考文獻(xiàn)： [1] Jun H L, Chan H T. A simple rapid and effective method for total RNA extraction from Tendentiousness [J]. Biotechnology, 2006, 28: 1193-1197 [2] Brooks，Joseph，Edward F Kitsch，Thomas Mannerist．Molec

40、ular Cloning．Cold spring harbor laboratory press New York，1989，2． [3]秦玉蓉，陳蓉，吳海，等．鵪鶉血液中小分子 RNA 表達(dá)的初步研究[J]． 中國(guó)家禽，2008， 30( 16) :20 -22． [4]王桂玲，黃東陽(yáng)，劉戈飛.一種從動(dòng)物組織中提取高質(zhì)量總 RNA 的方法[J]. 生命科學(xué)研究,2003,03:275-278. [5]王桂玲，劉戈飛，黃東陽(yáng). 從動(dòng)物組織提取高質(zhì)量總 RNA 方法的改進(jìn)[J]. 生物技術(shù)通訊,2003,06:512-514. [6]Chomsky P, Sac chi N. S

41、ingle step method of RNA isolation by acid theatre-in-the-round phenol- chloroform extraction [J]. Biochemist, 1987, 162: 156- 159 [7]陳暉,何海福.植物組織總 RNA 提取方法的研究進(jìn)展[J].甘肅農(nóng)業(yè),2006,8:228-230 Chen H, He H F. Progress of Extraction Methods for Plant Tissues Total RNA [J]. Journal of Ginsu Agriculture, 2006

42、, 8: 228-230 [8]楊占軍,谷守琴,張健.幾種植物組織總 RNA 提取方法的特點(diǎn)及疑難對(duì)策[J].安徽農(nóng)業(yè)科 學(xué),2009,37(18):8341- 8342 Yang Z J, G S Q, Bhang J. Characteristics of Several Extraction Methods on Total RNA in Plant Tissues and Strategies to Problems [J]. Journal of Inhuman Agni Sci, 2009, 37(18): 8341-8342 [9]吳麗娟,黎燕,胡美茹,等.改進(jìn) ADS-

43、Phenol 法快速提取細(xì)胞總 RNA[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué) 報(bào),1999,1(21):57-59 Wu L J, Li Y, H M R, ET AL. Preparation of cellular total RNA by improved ADS-phenol method [J]. Ac ta Academe Medic Militants Inertial, 1999, 1(21), 57-59 [10] 姚玉新 , 趙玲玲 , 郝玉金 , 等 . 改 良 熱 硼 酸 法 高 效 提 取 蘋(píng) 果 果 RNA[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào),2005,22(6):737-740 Fao

44、Y X, Chaos L L, Fao Y J, ET AL. A Modified B orate Method Significantly Enhances the Yield of High-Quality RNA from Apple Pulp [J]. Journal of Fruit Science, 2005, 22(6): 737-740 [11] Chung H W. Reverse transcribe PCR (CRT) and quantitative PCR (QC PCR)[J]. Exp Col Med, 2001, 33(11): 85-97. [13]B

45、lotta I, Prescind F, Mir ante S, ET AL. Quantitative assay of total Sedna with Greengrocer reagent and real-time fluorescent detection [J]. Ann 1st Super Sanitarium, 2005, 41(1): 119. [14]黃留玉.PCR 最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 131-139. [15] 徐楠楠, 胡桂學(xué). 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2011,21:

46、24-27. [16]王力均,許恒毅,熊勇華,等. 熒光定量 PCR 在大腸桿菌 O157:H7 檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 食品科學(xué),2013,11:358-362. [17]郭慧娟. 利用熒光定量 PCR 檢測(cè) PCV2 的方法建立及應(yīng)用[D].天津農(nóng)學(xué)院,2014. [18]曾慶賀. 布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 快速檢測(cè)方法的建立和臨床應(yīng)用的初步研究[D].吉林大學(xué),2014. [19]王惠娥,孫獻(xiàn)瑩,高慶華,等．奶牛精子 RNA 提取［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38( 3) :80- 84． [20]李燕,王恩秀,陳溥言．幾種提取 RNA 的方法［J］．生物技術(shù)，

47、2002，12( 4) :20 -21． [21]Tan S C, Apia B C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present[J]. Bio med Research International, 2013, 2009(1110-7243):574398. [22]張麗, 楊蓮茹, 吳紹強(qiáng). 核酸提取方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2011, 28(12):75-78. [23] 陳星, 潘迎捷, 孫曉紅, 趙勇. 細(xì)菌總 RNA 提取方法的研究進(jìn)展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科 學(xué),2010,(05):9-11.