羊水細(xì)胞等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制作.ppt

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羊水細(xì)胞等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制作技術(shù)與原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種： 一種是群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層； 另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱(chēng)為克?。╟lone）。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。 此外，為了制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法，使用大容量的圓培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)過(guò)程中不斷地轉(zhuǎn)動(dòng)，使培養(yǎng)的細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁。,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）,細(xì)胞培養(yǎng)基本條件,1、合適的細(xì)胞培養(yǎng)基 合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng) 和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。,2、優(yōu)質(zhì)血清 目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分。,3、無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒，及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。,4、恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。 5、合適的氣體環(huán)境 氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。,正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。,原代培養(yǎng) （primary culture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以?xún)?nèi)）停止生長(zhǎng)，需要從更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱(chēng)為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。 細(xì)胞株（cell strain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過(guò)程中其特征始終保持。,細(xì)胞系（cell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無(wú)限繁殖 克?。╟lone）：亦稱(chēng)無(wú)性繁殖系或簡(jiǎn)稱(chēng)無(wú)性系。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。,培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程,體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代（Passage或Subculture）。,每次傳代以后，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響。另外，很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞，在體外的生存也不是無(wú)限的，存在著一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。,所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。 正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類(lèi)和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段： 1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期； 2．傳代期； 3．衰退期。,1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期,也稱(chēng)初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。 此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。 初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大，多呈二倍體核型。,2．傳代期,初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系（Cell Line）。 在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。 為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。 一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期,3．衰退期,此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。 在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。,組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增（Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：,1．潛伏期,細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱(chēng)貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類(lèi)、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。,貼附是貼附類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。 細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。 細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。,2．指數(shù)增生期,這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。,指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)接觸抑制（Contact Inhibition）。 腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）。,3．停滯期（Stagnate Phase）：,細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。 此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱(chēng)平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。,細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇,選擇培養(yǎng)基沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞株時(shí)咨詢(xún)。 (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。,(3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無(wú)煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。,2、常用設(shè)施及設(shè)備,（1）超凈工作臺(tái)：也稱(chēng)凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類(lèi)。,（2）無(wú)菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等。 操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時(shí)鐘、普通天平及日常分析處理物 洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。,細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作基本技術(shù),工作環(huán)境的處理 使用層流超凈工作臺(tái)是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。超凈工作臺(tái)正常工作時(shí)，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺(tái)。,（1）實(shí)驗(yàn)前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)。如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，則用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，再讓無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作。,（2）無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時(shí)移出，以利氣體流通。實(shí)驗(yàn)用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。,（3）小心取出無(wú)菌實(shí)驗(yàn)用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開(kāi)的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺(tái)面上。,（4）工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實(shí)驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無(wú)菌操作臺(tái)（至少兩級(jí)）。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳物品傷人等。,（5）定期檢查下列項(xiàng)目：CO2 鋼瓶?jī)?nèi)的CO2 壓力；CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染；無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA 過(guò)濾器濾膜，預(yù)濾網(wǎng)﹙300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。,人羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備,人的羊水細(xì)胞能長(zhǎng)成單層并可連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，但它們的一些特征與一般成纖維細(xì)胞不同。在羊水中存在著各種不同類(lèi)型的胎兒細(xì)胞，依據(jù)其外形和生長(zhǎng)特征可區(qū)分為以下三類(lèi)：上皮細(xì)胞（E）、成纖維細(xì)胞（F）和羊水細(xì)胞（AF）。,E細(xì)胞在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長(zhǎng)，所以在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)期最短。 AF細(xì)胞在再培養(yǎng)中一開(kāi)始就長(zhǎng)得很好，染色體分析大多用這類(lèi)細(xì)胞。 F細(xì)胞在再培養(yǎng)中潛在的生長(zhǎng)期最長(zhǎng)，在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢(shì)。,通常在培養(yǎng)后3—4天（可能更早些）即出現(xiàn)E細(xì)胞的集落，它們不適合再培養(yǎng)作染色體分析。大約在第7天出現(xiàn)的AF細(xì)胞可被用于染色體制備。如果在培養(yǎng)后第10天還未見(jiàn)長(zhǎng)出新的細(xì)胞，就應(yīng)考慮第二次羊膜穿刺。,實(shí)驗(yàn)用品、實(shí)驗(yàn)試劑,見(jiàn)實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè),內(nèi)容與方法,（一）細(xì)胞接種與培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml離心管中，共抽4管約32ml，立即送檢 進(jìn)室后，以1500rpm離心10min 進(jìn)無(wú)菌室，在無(wú)菌操作臺(tái)上吸去上清液，每管約留0.5ml，吸管打散細(xì)胞。制成細(xì)胞懸液，再加入約4.5ml完全培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管輕混勻，移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中置含5%CO2的37℃溫箱行開(kāi)放式培養(yǎng),一般5天后鏡下觀察，可見(jiàn)成纖維樣或上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì)胞時(shí)，視情況（有較好的梭形細(xì)胞克隆）可換上換液用培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，如細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml, (20ug/ml，7號(hào)針頭垂直加2滴)4-6小時(shí)左右行細(xì)胞學(xué)處理,（二）細(xì)胞收獲 倒出瓶中細(xì)胞液入10ml離心管，0.85%NaCl沖洗細(xì)胞壁兩遍 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分鐘，待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)皺形改變時(shí)即用吸管吹打細(xì)胞。 收集細(xì)胞懸液：離心，1500rpm，10min，去上清,低滲：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml，低滲10min)。 預(yù)固定：加入1.5ml左右，輕混勻37℃水浴5min， 離心,1500rpm,10min。 固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴10min,室溫1500rpm離心10min，去上清，約留0.5ml 重復(fù)固定：同上 離心，1500rpm，10min，去上清 調(diào)懸液：視管底細(xì)胞量加入幾滴新鮮固定劑，并吹打混勻,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片：75℃烤箱烘烤3小時(shí) 第二天行顯帶處理：同外周血,注意事項(xiàng),羊水標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送檢，送檢過(guò)程中不宜受熱或冰凍，實(shí)驗(yàn)人員收到羊水后應(yīng)先觀察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否為血性羊水；羊水中少量紅細(xì)胞不需處理,如有明顯血性羊水,立即在羊水中加入無(wú)菌肝素一滴。,接種所用器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。 離心時(shí)，一定要注意離心機(jī)內(nèi)溫度，必須達(dá)到室溫方可離心。 培養(yǎng)基pH為7.2-7.4也是羊水細(xì)胞開(kāi)放式培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。 注意接種時(shí)培養(yǎng)基不能加得過(guò)多，臥倒瓶子時(shí)，培養(yǎng)基不能接觸瓶蓋；,羊水培養(yǎng)首先必須有好的培養(yǎng)基 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于營(yíng)養(yǎng)成份較少,羊水細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng),培養(yǎng)成功率低。 國(guó)內(nèi)有些學(xué)者通過(guò)添加生長(zhǎng)因子或用血清代用品來(lái)培養(yǎng)羊水,但步驟繁瑣,也容易造成污染。,要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，來(lái)決定所要收獲的時(shí)間。 抓住細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)期相當(dāng)重要，如羊水為血性羊水或胎質(zhì)較多須給予不同的處理。 要收獲較多的分裂相,必須在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)收獲。,收獲標(biāo)準(zhǔn)：于10倍目鏡和4倍物鏡下觀察: ①以梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞(AF細(xì)胞)為主要類(lèi)型的生長(zhǎng)細(xì)胞,形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個(gè)或1個(gè)以上的完整視野。 ②培養(yǎng)瓶中有2～3個(gè)以上細(xì)胞克隆,且每個(gè)細(xì)胞克隆中存在有20個(gè)以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細(xì)胞。 ③細(xì)胞克隆中央的細(xì)胞開(kāi)始老化,克隆周邊細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。,收獲細(xì)胞時(shí)要掌握好低滲時(shí)間及低滲液的量，吹打時(shí)力度要均勻，滴片濃度不能太高，以免細(xì)胞不分散。培養(yǎng)收獲時(shí)間大多數(shù)為9～10天,最早收獲在第7天,最長(zhǎng)14天。顯帶時(shí)，胰酶消化時(shí)間一般比外周血要稍長(zhǎng)，但需根據(jù)其胰酶活性而定。,絨毛細(xì)胞培養(yǎng)與染色體制備,絨毛細(xì)胞由受精卵發(fā)育分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞及絨毛間質(zhì)中的胚外中胚層細(xì)胞組成，絨毛細(xì)胞與胎兒組織同源，通過(guò)絨毛檢測(cè)，可客觀反映胎兒情況。絨毛既可以直接制片進(jìn)行染色體的觀察，也可以經(jīng)培養(yǎng)制備染色體，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。,內(nèi)容與方法,挑選孕6-8周孕婦，詢(xún)問(wèn)病史、進(jìn)行婦科檢查，以確定早孕，了解子宮大小，位置、彎曲情況及胚胎著床情況 拭去宮頸粘液，嚴(yán)密消毒宮頸及宮頸管下段，一般可不用宮頸鉗，如子宮過(guò)度前屈或后屈，則有助手用宮頸鉗輕拉子宮向下固定,用消毒塑料吸管按子宮的自然彎曲方向，沿著子宮壁輕輕進(jìn)入子宮腔，直至有阻力感為止，一般進(jìn)入子宮頸外口6-10cm（根據(jù)妊娠天數(shù)及宮頸長(zhǎng)度而定）切忌反復(fù)進(jìn)退，以防剝離面大，然后用空針抽吸，同時(shí)退出塑料管，大多可吸出少許血液，絨毛枝便夾在其中,在無(wú)菌條件下，將絨毛組織放入玻璃平皿中，用含400U/ml雙抗的0.85%NaCl反復(fù)沖洗絨毛組織2-3次以去除血液，然后除去并吸凈生理鹽水,（一）消化法 （1）經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后，在玻璃平皿用眼科手術(shù)剪將絨毛組織剪碎,放入裝有30-50倍組織量的0.25% EDTA-trypin的三角燒瓶中，37℃下,20-30min即可 (2)將三角燒瓶中的組織溶液裝入離心管，離心,1000rpm,10min,(3)去上清，加入20 ml PBS,打勻 (4)離心,1000rpm,10min (5)去上清，加入20 ml PBS,打勻 (6)細(xì)胞計(jì)數(shù)：106/25cm2接種,(二)貼壁法 經(jīng)低倍鏡下鑒定為絨毛枝后，在玻璃平皿用眼科手術(shù)剪剪成1-2mm3小枝或小塊，移入25cm2培養(yǎng)瓶中，用牙科探針將組織均勻分散于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼壁面，組織塊的間距約為0.5cm-1cm,于對(duì)側(cè)瓶壁加入含50%血清的培養(yǎng)基，pH為7.2-7.4，37℃培養(yǎng)2-3小時(shí)待組織貼壁牢固后，即可翻瓶，使組織塊泡在培養(yǎng)液中,(三)收獲細(xì)胞及染色體制片 每天觀察，一般3-7天可見(jiàn)上皮樣或成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)情況每隔5-7天換液一次。一般培養(yǎng)6-20天，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)，按下列程序處理：,加入秋水仙素0.02-0.04ug/ml讓其過(guò)夜，約14小時(shí)左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收獲 將培養(yǎng)液倒入離心管中，加入PBS或生理鹽水2-3毫升，洗凈完全培養(yǎng)基，加0.25% EDTA-trypsin約2ml消化3-5min，完全培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離心，1500rpm ，10min,低滲：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%檸檬酸鈉1∶1作為低滲液,每管8ml，低滲10min) 預(yù)固定：加入1.5ml左右，輕混勻37℃水浴3min，離心,1500rpm,10min 固定：加入3:1固定劑8ml左右，輕混勻，37℃水浴15min,室溫1500rpm離心10min，去上清，約留0.5ml 重復(fù)固定：同上 離心，1500rpm，10min，去上清 視管底細(xì)胞量加入適當(dāng)幾滴新鮮固定劑,滴片：每片1-2滴, 滴片4-6張 烤片：75℃烤箱烘烤3小時(shí) 第二天行顯帶處理：同外周血,注意事項(xiàng),嚴(yán)格無(wú)菌操作是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵； 視細(xì)胞分裂旺盛情況加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、 4-6小時(shí)也可考慮收獲； 在用0.25% EDTA-trypsin消化之前盡量將瓶壁血清洗凈，更有利于快速消化； 低滲之后每一步均應(yīng)輕吹打，用力過(guò)大可能損失掉較多細(xì)胞。,Thank you!,