《醫(yī)學細胞生物學》本科教學課件

《醫(yī)學細胞生物學》本科教學課件,醫(yī)學細胞生物學,醫(yī)學,細胞生物學,本科,教學,課件 第十五章 細胞的衰老與死亡教材名稱教材名稱 醫(yī)學細胞生物學醫(yī)學細胞生物學目 錄第一節(jié) 細胞衰老1第二節(jié) 細胞死亡2一、細胞衰老的概念v細胞衰老（細胞衰老（cell aging或或cell senescence）是指是指隨著時間的推移，隨著時間的推移，細胞增殖能力細胞增殖能力和和生理功能生理功能逐漸逐漸下降的變化過程。下降的變化過程。正常成纖維細胞衰老的成纖維細胞的不同形態(tài)學改變v細胞衰老有兩層含義一是指其增殖分化的停止，細胞衰老有兩層含義一是指其增殖分化的停止，二是指其同時能夠維持細胞基本的代謝活動。二是指其同時能夠維持細胞基本的代謝活動。v細胞衰老是機體的衰老和老年病發(fā)病的基礎細胞衰老是機體的衰老和老年病發(fā)病的基礎.（一）（一）細胞衰老與機體衰老細胞衰老與機體衰老v細胞的衰老與機體的衰老既有區(qū)別又有聯(lián)系細胞的衰老與機體的衰老既有區(qū)別又有聯(lián)系v機體衰老是指隨著年齡的增加，機體功能呈現(xiàn)機體衰老是指隨著年齡的增加，機體功能呈現(xiàn)退退行性變化行性變化，并伴隨，并伴隨生殖能力下降和死亡率上升生殖能力下降和死亡率上升的過的過程，是一個受發(fā)育程序、環(huán)境因子等多種因素控制程，是一個受發(fā)育程序、環(huán)境因子等多種因素控制的、不可逆的生物學現(xiàn)象。的、不可逆的生物學現(xiàn)象。v細胞衰老是機體衰老的細胞衰老是機體衰老的基礎基礎和直接和直接原因原因，機體衰，機體衰老是建立在總體細胞衰老的基礎上，各種衰老都有老是建立在總體細胞衰老的基礎上，各種衰老都有其細胞學基礎。其細胞學基礎。（二）（二）機體內各類細胞的壽命機體內各類細胞的壽命v1.不能更新組織細胞不能更新組織細胞 細胞高度分化，細胞在個體發(fā)細胞高度分化，細胞在個體發(fā)育早期增殖分化成熟后，一般情況下不能再分裂與分育早期增殖分化成熟后，一般情況下不能再分裂與分化，即機體一生中沒有同類細胞更替補充?；?，即機體一生中沒有同類細胞更替補充。v2.相對穩(wěn)定組織細胞相對穩(wěn)定組織細胞 細胞的分化程度較高，通常不細胞的分化程度較高，通常不分裂，但終生保留有分裂的能力，一般在同類細胞受分裂，但終生保留有分裂的能力，一般在同類細胞受到損傷導致細胞數(shù)量減少時重新進入細胞周期，進行到損傷導致細胞數(shù)量減少時重新進入細胞周期，進行分裂繁殖。分裂繁殖。v3.不斷更新組織細胞不斷更新組織細胞 指某些特化的組織細胞，它們指某些特化的組織細胞，它們在執(zhí)行自身生命活動的過程中會發(fā)生自然衰老死亡，同在執(zhí)行自身生命活動的過程中會發(fā)生自然衰老死亡，同時由新生細胞不斷再生成熟來補充。時由新生細胞不斷再生成熟來補充。v可分為可分為3種：種：干細胞，具有自我更新和多向分化能干細胞，具有自我更新和多向分化能力；力；過渡細胞，由干細胞增殖分化而來，是能隨著細過渡細胞，由干細胞增殖分化而來，是能隨著細胞分裂趨向成熟的中間細胞；胞分裂趨向成熟的中間細胞；成熟細胞，不再分裂，成熟細胞，不再分裂，在執(zhí)行生命活動的過程中逐步衰老和死亡。在執(zhí)行生命活動的過程中逐步衰老和死亡。v4.可耗盡組織細胞可耗盡組織細胞 如人類的卵巢實質細胞，在一生如人類的卵巢實質細胞，在一生中逐漸消耗，而不能得到補充，最后消耗殆盡。中逐漸消耗，而不能得到補充，最后消耗殆盡。v一般情況下，體內更新較快的細胞，其壽命較短；體一般情況下，體內更新較快的細胞，其壽命較短；體內基本不更新的細胞，在分化成熟后可以保持與機體相內基本不更新的細胞，在分化成熟后可以保持與機體相同的壽命。同的壽命。成年小鼠各類細胞的壽命成年小鼠各類細胞的壽命（三）細胞在體外培養(yǎng)條件下的壽命（三）細胞在體外培養(yǎng)條件下的壽命v Hayflick界限（界限（Hayflick limitation）體外培養(yǎng)的二倍體外培養(yǎng)的二倍體細胞的增殖能力和壽命不是無限的，而是有一定的限體細胞的增殖能力和壽命不是無限的，而是有一定的限度度。v體外培養(yǎng)的二倍體細胞的增殖能力反映了它們在體內體外培養(yǎng)的二倍體細胞的增殖能力反映了它們在體內的衰老狀況，而且其的衰老狀況，而且其分裂次數(shù)與供體年齡之間成反比的分裂次數(shù)與供體年齡之間成反比的關系關系。v不同物種的不同物種的細胞最大分裂次數(shù)與動物平均壽命成正比細胞最大分裂次數(shù)與動物平均壽命成正比的關系的關系。（四）細胞的復制衰老和脅迫誘導衰老（四）細胞的復制衰老和脅迫誘導衰老1.細胞的復制衰老細胞的復制衰老v復制衰老（replicative senescence，RS）是是指體外培養(yǎng)指體外培養(yǎng)的正常細胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細胞逐的正常細胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細胞逐漸衰老直至死亡的現(xiàn)象，即前面提到的漸衰老直至死亡的現(xiàn)象，即前面提到的HayflickHayflick界限。界限。2.細胞的脅迫誘導衰老細胞的脅迫誘導衰老v環(huán)境因素對細胞產生脅迫壓力，可誘導細胞產生脅迫環(huán)境因素對細胞產生脅迫壓力，可誘導細胞產生脅迫性衰老，加速或提早使細胞出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，也稱為細胞性衰老，加速或提早使細胞出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，也稱為細胞病理性衰老。病理性衰老。二、細胞衰老的表現(xiàn)（一）細胞衰老的形態(tài)結構變化（一）細胞衰老的形態(tài)結構變化v1.細胞體積縮小細胞體積縮小 衰老細胞內水分減少，結果使細胞衰老細胞內水分減少，結果使細胞萎縮、體積變小，原生質濃縮，黏稠度增加，失去正常萎縮、體積變小，原生質濃縮，黏稠度增加，失去正常的形態(tài)。的形態(tài)。v2.細胞膜變化細胞膜變化v3.細胞核的變化細胞核的變化 核膜內陷（核膜內陷（invagination），染色染色質的固縮化質的固縮化。v4.線粒體的老化線粒體的老化 線粒體的老化是細胞衰老的重要原線粒體的老化是細胞衰老的重要原因之一。線粒體數(shù)量隨細胞年齡的增大而減少，體積隨因之一。線粒體數(shù)量隨細胞年齡的增大而減少，體積隨年齡增大而增大。年齡增大而增大。v5.內質網(wǎng)的老化內質網(wǎng)的老化v6.高爾基復合體的變化高爾基復合體的變化v7.致密體的生成致密體的生成 致密體（dense body）是衰老細胞中常見的色素顆粒狀沉積，絕大多數(shù)動物細胞在衰老時都會有致密體的積累。v8.細胞骨架體系的變化細胞骨架體系的變化二、細胞衰老的表現(xiàn)（二）細胞衰老的生物化學變化（二）細胞衰老的生物化學變化v復制能力的喪失及對促有絲分裂刺激的反應性減弱復制能力的喪失及對促有絲分裂刺激的反應性減弱是細胞衰老的標志之一。是細胞衰老的標志之一。v細胞衰老時細胞衰老時mRNA合成能力下降，合成能力下降，mRNA與核糖體與核糖體的結合能力降低。而的結合能力降低。而rRNA和和tRNA的變化沒有明顯的的變化沒有明顯的規(guī)律。規(guī)律。v衰老細胞內蛋白質合成速率下降，酶含量減少、功衰老細胞內蛋白質合成速率下降，酶含量減少、功能降低。能降低。三、細胞衰老的學說與機制三、細胞衰老的學說與機制（一）遺傳程序學說（一）遺傳程序學說v該學說認為每一物種本身都有固有的遺傳基因上的衰該學說認為每一物種本身都有固有的遺傳基因上的衰老程序，衰老是遺傳上的程序化過程，其推動力和決定老程序，衰老是遺傳上的程序化過程，其推動力和決定因素是遺傳的基因組；控制生長發(fā)育和衰老的基因按照因素是遺傳的基因組；控制生長發(fā)育和衰老的基因按照預定程序在特定時期有序地開啟和關閉。預定程序在特定時期有序地開啟和關閉。Werners syndrome Hutchinson-Gilford syndrome A mutant model mouse is useful for studies of aging.The klotho phenotype(premature aging)is caused by a disruption of the single gene,klotho.三、細胞衰老的學說與機制三、細胞衰老的學說與機制（二）端粒（二）端粒-端粒酶學說端粒酶學說v端粒（端粒（telomere）是染色體末端的一種特殊結構，其是染色體末端的一種特殊結構，其DNADNA由簡單的串聯(lián)重復序列組成。人類的染色體端粒由由簡單的串聯(lián)重復序列組成。人類的染色體端粒由TTAGGG/CCCTAATTAGGG/CCCTAA重復序列組成。重復序列組成。v端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種由是一種由RNARNA和蛋白質組成的核和蛋白質組成的核糖核蛋白酶，常見于糖核蛋白酶，常見于生殖細胞和腫瘤細胞生殖細胞和腫瘤細胞等細胞中，而等細胞中，而正常的體細胞中則缺乏端粒酶或端粒酶活性很低。正常的體細胞中則缺乏端粒酶或端粒酶活性很低。v端粒端粒-端粒酶學說認為，隨著細胞分裂端粒長度會逐端粒酶學說認為，隨著細胞分裂端粒長度會逐漸縮短，端粒最終縮短到一定的長度或是改變端粒結漸縮短，端粒最終縮短到一定的長度或是改變端粒結構，端粒就會失去端粒結合蛋白的保護而激活衰老信構，端粒就會失去端粒結合蛋白的保護而激活衰老信號，誘導細胞衰老。號，誘導細胞衰老。（三）自由基學說（三）自由基學說v該學說認為細胞在正常的代謝活動中會產生自由基該學說認為細胞在正常的代謝活動中會產生自由基（free radical），自由基對細胞成分具有損傷作用，），自由基對細胞成分具有損傷作用，細胞的損傷積累引起了細胞的衰老。細胞的損傷積累引起了細胞的衰老。v自由基是指那些在原子核外層軌道上具有不成對電自由基是指那些在原子核外層軌道上具有不成對電子的分子或原子基團，當自由基與其他分子反應時，子的分子或原子基團，當自由基與其他分子反應時，產生的活性氧基團（產生的活性氧基團（reactive oxygen species，ROS）導致細胞結構發(fā)生氧化性損傷導致細胞結構發(fā)生氧化性損傷。自由基自由基自由基導致細胞損傷：自由基導致細胞損傷：質膜中質膜中不飽和脂肪酸不飽和脂肪酸氧化，導致膜運輸功能紊亂以至喪失。氧化，導致膜運輸功能紊亂以至喪失。蛋白質蛋白質的巰基化，造成蛋白質發(fā)生交聯(lián)、變性，使酶失活。的巰基化，造成蛋白質發(fā)生交聯(lián)、變性，使酶失活。DNA鏈鏈的斷裂、交聯(lián)、堿基羥基化、堿基切除等，對的斷裂、交聯(lián)、堿基羥基化、堿基切除等，對DNA造造成損傷。成損傷。v人體內自由基產生的主要途徑：人體內自由基產生的主要途徑：v環(huán)境中的高溫、輻射、光解、化學物質等引起的環(huán)境中的高溫、輻射、光解、化學物質等引起的外源性自由基；外源性自由基；v體內各種代謝反應產生的內源性自由基。內源性體內各種代謝反應產生的內源性自由基。內源性自由基是人體自由基的主要來源，其產生途徑有：一自由基是人體自由基的主要來源，其產生途徑有：一是由線粒體呼吸鏈電子泄露產生；二是過氧化物酶體是由線粒體呼吸鏈電子泄露產生；二是過氧化物酶體的多功能氧化酶（的多功能氧化酶（microsomal mixed function oxidases，MFO）等催化底物羥化產生。）等催化底物羥化產生。清除自由基的防御系統(tǒng)清除自由基的防御系統(tǒng) 抗氧化酶系統(tǒng)：抗氧化酶系統(tǒng)：SODSOD、過氧化氫酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、過氧化物酶 谷胱甘肽過氧化物酶。谷胱甘肽過氧化物酶?？寡趸瘎壕S抗氧化劑：維A,C,EA,C,E、硒、半胱氨酸，谷胱甘肽、硒、半胱氨酸，谷胱甘肽。（四）其他細胞衰老學說（四）其他細胞衰老學說v1.大分子交聯(lián)學說v2.錯誤成災說v3.神經(jīng)內分泌免疫調節(jié)學說四、細胞衰老與疾病四、細胞衰老與疾病v一些人類疾病在生命的早期階段就表現(xiàn)出衰老表型快速進展一些人類疾病在生命的早期階段就表現(xiàn)出衰老表型快速進展相關特征，這些疾病特征與正常衰老過程有著驚人的相似之相關特征，這些疾病特征與正常衰老過程有著驚人的相似之處，稱為早老性疾病。早老性疾病共同特點是它們均存在處，稱為早老性疾病。早老性疾病共同特點是它們均存在DNADNA損傷修復缺陷。損傷修復缺陷。v隨著年齡的增加，成體組織中的干細胞也在逐漸衰隨著年齡的增加，成體組織中的干細胞也在逐漸衰老，干細胞的衰老將導致其自我更新和多向分化能老，干細胞的衰老將導致其自我更新和多向分化能力的衰退，甚至增殖分化失控，導致?lián)p傷組織難以力的衰退，甚至增殖分化失控，導致?lián)p傷組織難以修復、組織器官結構與功能的衰退，相關疾病相伴修復、組織器官結構與功能的衰退，相關疾病相伴而生。而生。目 錄第一節(jié) 細胞衰老1第二節(jié) 細胞死亡2v細胞死亡（細胞死亡（cell death）是指細胞生命現(xiàn)象的終結。）是指細胞生命現(xiàn)象的終結。細胞衰老的結果是死亡，但細胞死亡并非都是由衰細胞衰老的結果是死亡，但細胞死亡并非都是由衰老引起的。老引起的。v傳統(tǒng)的細胞死亡方式分類包括細胞壞死傳統(tǒng)的細胞死亡方式分類包括細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（）和細胞凋亡（apoptosis）兩種。）兩種。v近年來國際上多數(shù)學者將細胞的死亡形式分為近年來國際上多數(shù)學者將細胞的死亡形式分為細胞細胞凋亡、細胞壞死凋亡、細胞壞死和和自噬性細胞死亡自噬性細胞死亡三種。三種。一、細胞凋亡一、細胞凋亡（一）細胞凋亡的概念（一）細胞凋亡的概念v細胞凋亡（細胞凋亡（apoptosis）是多細胞生物調控機體發(fā)是多細胞生物調控機體發(fā)育、維護內環(huán)境穩(wěn)定，由育、維護內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制基因控制的的主動的主動的生理性細生理性細胞胞自殺行為自殺行為，是細胞生理性死亡的普遍形式。，是細胞生理性死亡的普遍形式。細胞皺縮、染色質凝聚、凋亡小體形成、細胞骨架細胞皺縮、染色質凝聚、凋亡小體形成、細胞骨架解體解體等，其中以胞核的變化最為顯著。等，其中以胞核的變化最為顯著。(二二)細胞凋亡的特征細胞凋亡的特征核濃縮、核膜皺縮核濃縮、核膜皺縮1.細胞凋亡的形態(tài)學特征細胞凋亡的形態(tài)學特征凋亡的起始凋亡的起始 細胞細胞皺縮皺縮，體積變小，胞質濃縮；，體積變小，胞質濃縮；細胞表面細胞表面微絨毛消失微絨毛消失，細胞間，細胞間接觸消失接觸消失；胞胞膜完整膜完整，但未失去選擇通透性；磷酯酰絲氨酸外翻；，但未失去選擇通透性；磷酯酰絲氨酸外翻；線粒體基本完整，但體積增大，嵴增多，出現(xiàn)空泡化；線粒體基本完整，但體積增大，嵴增多，出現(xiàn)空泡化；內質網(wǎng)腔膨大；內質網(wǎng)腔膨大；核內染色質凝集，成新月形帽狀結構，分布于核內緣（核內染色質凝集，成新月形帽狀結構，分布于核內緣（染色染色 質邊聚質邊聚），），核濃縮、裂碎核濃縮、裂碎。凋亡小體的形成凋亡小體的形成 染色質斷裂成片段，染色質斷裂成片段，與某些細胞器聚集，與某些細胞器聚集，被膜包圍。被膜包圍。A.正常細胞正常細胞 B.微絨毛消失微絨毛消失 C.凋亡小體凋亡小體掃描電鏡下的凋亡細胞表面變化掃描電鏡下的凋亡細胞表面變化（山東大學辛華提供）凋亡小體（凋亡小體（apoptosis body)凋亡細胞經(jīng)過類似胞吐的方式，形凋亡細胞經(jīng)過類似胞吐的方式，形成的球形突起，內含胞質、細胞器成的球形突起，內含胞質、細胞器以及染色質片段。以及染色質片段。凋亡細胞的清除凋亡細胞的清除 脫落的凋亡小體逐漸被鄰近細胞或體內吞噬細胞吞噬，脫落的凋亡小體逐漸被鄰近細胞或體內吞噬細胞吞噬，殘余物被消化后重新利用。殘余物被消化后重新利用。細胞凋亡最主要的特征是整個過程細胞凋亡最主要的特征是整個過程細胞膜保持相對細胞膜保持相對完整完整，細胞內含無不發(fā)生外泄，細胞內含無不發(fā)生外泄，不會引起炎性反應不會引起炎性反應。1.DNA片段化片段化細胞凋亡時，內源性核酸內切酶活化，特異地在細胞凋亡時，內源性核酸內切酶活化，特異地在相鄰核小體的連接區(qū)切斷相鄰核小體的連接區(qū)切斷DNA鏈，形成長度為鏈，形成長度為180200bp整數(shù)倍的寡聚核苷酸片段，在進行瓊脂整數(shù)倍的寡聚核苷酸片段，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，凋亡細胞表現(xiàn)出特征性的糖凝膠電泳時，凋亡細胞表現(xiàn)出特征性的DNA梯梯狀條帶（狀條帶（DNA ladders）。）。2.2.凋亡細胞的生化改變凋亡細胞的生化改變凋亡細胞凋亡細胞DNA凝膠電泳時呈現(xiàn)梯狀條帶凝膠電泳時呈現(xiàn)梯狀條帶A.細胞凋亡中細胞凋亡中DNA內切酶的活化內切酶的活化 B.細胞凋亡所形成的細胞凋亡所形成的180200bp整倍性整倍性DNA片段片段 2.細胞凋亡中的蛋白酶細胞凋亡中的蛋白酶 細胞凋亡是通過多種蛋白酶控制的，細胞凋亡是通過多種蛋白酶控制的，蛋白酶級聯(lián)蛋白酶級聯(lián)切割切割是凋亡最關鍵的過程。是凋亡最關鍵的過程。caspase天冬氨酸特異性的半天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶胱氨酸蛋白水解酶4線粒體在細胞凋亡中的作用線粒體在細胞凋亡中的作用呼吸鏈受損呼吸鏈受損，能量代謝受到破壞，導致細胞死亡；，能量代謝受到破壞，導致細胞死亡；釋放釋放細胞色素細胞色素C（cytochrome C,cyt C），激活半胱氨酸天），激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；冬氨酸蛋白酶；產生產生活性氧類物質活性氧類物質（ROS）線粒體膜線粒體膜通透性增高通透性增高，觸發(fā)級聯(lián)反應。，觸發(fā)級聯(lián)反應。3.胞漿胞漿Ca2+、pH的變化的變化 胞漿內胞漿內Ca2+濃度升高濃度升高細胞凋亡與細胞壞死的形態(tài)比較細胞凋亡與細胞壞死的形態(tài)比較 細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別 特征特征 細胞凋亡細胞凋亡 細胞壞死細胞壞死誘導因素誘導因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 強烈刺激強烈刺激受累范圍受累范圍 單個細胞丟失單個細胞丟失 成群細胞死亡成群細胞死亡膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即喪失早期即喪失細胞體積細胞體積 減少、固縮減少、固縮 增大、腫脹增大、腫脹染色質染色質 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成網(wǎng)狀稀疏成網(wǎng)狀細胞器細胞器 無明顯變化無明顯變化 腫張破壞腫張破壞溶酶體溶酶體 保持完整保持完整 破壞外溢破壞外溢細胞形狀細胞形狀 形成凋亡小體形成凋亡小體 破裂成碎片破裂成碎片基因組基因組DNA 有控降解有控降解 隨機降解隨機降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因調控基因調控 有有 無無后果后果 不引起炎癥反應不引起炎癥反應 引起炎癥反應引起炎癥反應意義意義 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式 電鏡下的凋亡細胞電鏡下的凋亡細胞(A-B)與壞死細胞與壞死細胞(C)（三）細胞凋亡的檢測方法（三）細胞凋亡的檢測方法1.形態(tài)學觀察形態(tài)學觀察v應用各種染色法可觀察凋亡細胞的形態(tài)學特征。應用各種染色法可觀察凋亡細胞的形態(tài)學特征。臺盼藍、臺盼藍、44，6-6-二脒基二脒基-2-2-苯基吲哚（苯基吲哚（DAPIDAPI）、）、吉姆薩（吉姆薩（GiemsaGiemsa）染色法）染色法DAPI 染色顯示凋亡細胞的染色質凝集 A.正常細胞核 B.凋亡細胞核2.DNA電泳電泳v從凋亡細胞中提取的從凋亡細胞中提取的DNA在進在進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳時，這行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳時，這些大小不同的些大小不同的DNA片段就呈現(xiàn)出片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶（梯狀條帶（DNA ladders）。）。v這一方法是鑒定細胞凋亡最為這一方法是鑒定細胞凋亡最為簡便可靠的方法之一。簡便可靠的方法之一。3.DNA斷裂的原位末端標記法斷裂的原位末端標記法v即轉移酶介導的即轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（缺口末端標記測定法（TUNEL）。）。v這一方法能對這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的分子斷裂缺口中的3-OH進行原位標記。進行原位標記。人淋巴瘤細胞經(jīng)喜樹堿處理人淋巴瘤細胞經(jīng)喜樹堿處理4h后，使用后，使用TUNEL Assay Kit 檢測。具有檢測。具有DNA鏈缺口的鏈缺口的凋亡細胞可通過凋亡細胞可通過TUNEL和綠色熒光檢測到，和綠色熒光檢測到，而壞死細胞則被紅色熒光的而壞死細胞則被紅色熒光的PI染色。染色。4.彗星電泳法彗星電泳法正常細胞的核無DNA 斷裂泳動時保持圓球形凋亡細胞中的DNA 降解片段在電場中泳動速度較快，細胞核呈現(xiàn)出慧星式圖案5.流式細胞分析流式細胞分析6.檢測細胞膜成分變化檢測細胞膜成分變化v檢測磷脂酰絲氨酸的外翻檢測磷脂酰絲氨酸的外翻v檢測檢測caspases 的激活的激活v檢測檢測Cyt c 的釋放的釋放v檢測線粒體膜電檢測線粒體膜電位的變化等位的變化等一、細胞凋亡一、細胞凋亡（四）凋亡的信號通路與分子機制（四）凋亡的信號通路與分子機制v由天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（由天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（cysteine aspartic acid specific protease，caspase）依賴的細胞凋亡信號轉導通路）依賴的細胞凋亡信號轉導通路主要有兩條：主要有兩條：死亡受體介導的信號通路死亡受體介導的信號通路線粒體信號通路線粒體信號通路共同特點共同特點:是富含半胱氨酸，被激活后能特異地切割靶蛋是富含半胱氨酸，被激活后能特異地切割靶蛋白的天冬氨酸殘基后的肽鍵。白的天冬氨酸殘基后的肽鍵。啟動凋亡啟動凋亡 caspase-2、8、9、10 執(zhí)行凋亡執(zhí)行凋亡 caspase-3、6、7 v每一條信號轉導通路不是孤立存在的，它們相互聯(lián)系，形成每一條信號轉導通路不是孤立存在的，它們相互聯(lián)系，形成 網(wǎng)絡。網(wǎng)絡。1.1.死亡受體介導的信號通路死亡受體介導的信號通路v死亡受體（死亡受體（death receptor，DR）是近年發(fā)現(xiàn)的一）是近年發(fā)現(xiàn)的一組細胞表面標記，細胞外的許多信號分子可以與細胞組細胞表面標記，細胞外的許多信號分子可以與細胞表面相應的死亡受體結合，激活凋亡信號通路，導致表面相應的死亡受體結合，激活凋亡信號通路，導致細胞凋亡。細胞凋亡。v哺乳動物的死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體哺乳動物的死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）和神經(jīng)生長因子受體超家族，目前已知的）和神經(jīng)生長因子受體超家族，目前已知的死亡受體主要有死亡受體主要有Fas、TRAIL（TNF Related Apoptosis Inducing Ligand）及）及TNFR。v它們都具有一個富含半胱氨酸的胞外結構域和一個它們都具有一個富含半胱氨酸的胞外結構域和一個同源的細胞質序列，也稱為死亡結構域（同源的細胞質序列，也稱為死亡結構域（death death domaindomain，DDDD）。死亡結構域在死亡受體傳導凋亡信號）。死亡結構域在死亡受體傳導凋亡信號中起到至關重要作用，它們與相應的配體結合后，可中起到至關重要作用，它們與相應的配體結合后，可以通過一系列的信號轉導過程，將外源性凋亡信號傳以通過一系列的信號轉導過程，將外源性凋亡信號傳遞到細胞內，引發(fā)細胞凋亡。遞到細胞內，引發(fā)細胞凋亡。死亡受體介導的信號通路死亡受體介導的信號通路2.2.線粒體信號通路線粒體信號通路v線粒體是內源性細胞凋亡的調控中心。線粒體是內源性細胞凋亡的調控中心。v當細胞受到內部或外部的凋亡信號刺激后，都可引當細胞受到內部或外部的凋亡信號刺激后，都可引起線粒體的起線粒體的損傷損傷和和膜通透性的改變膜通透性的改變，進而促進線粒體，進而促進線粒體釋放凋亡啟動因子。釋放凋亡啟動因子。v細胞色素細胞色素c c能與能與Apaf-1/Caspase-9Apaf-1/Caspase-9前體、前體、ATP/dATPATP/dATP形形成凋亡復合體，然后募集并激活成凋亡復合體，然后募集并激活Caspase-3Caspase-3，進而引，進而引發(fā)發(fā)CaspaseCaspase級聯(lián)反應，對凋亡信號進行放大，導致細級聯(lián)反應，對凋亡信號進行放大，導致細胞凋亡。胞凋亡。線粒體信號通路線粒體信號通路3.3.顆粒酶顆粒酶B B通路通路v細胞毒淋巴細胞（細胞毒淋巴細胞（CTLCTL）和自然殺傷細胞（）和自然殺傷細胞（NKNK）可以）可以通過釋放裂解顆粒進入免疫突出突觸來殺傷靶細胞。通過釋放裂解顆粒進入免疫突出突觸來殺傷靶細胞。這些顆粒中包括兩種關鍵的組成蛋白：穿孔素和顆粒這些顆粒中包括兩種關鍵的組成蛋白：穿孔素和顆粒酶酶B B。穿孔素通過穿透靶細胞的質膜在靶細胞表面形成微孔道，穿孔素通過穿透靶細胞的質膜在靶細胞表面形成微孔道，有利于顆粒酶有利于顆粒酶B B進入靶細胞激發(fā)細胞凋亡。進入靶細胞激發(fā)細胞凋亡。顆粒酶顆粒酶B B是一種外源性的絲氨酸蛋白酶，它可通過裂解并是一種外源性的絲氨酸蛋白酶，它可通過裂解并激活凋亡的執(zhí)行者激活凋亡的執(zhí)行者caspases-3caspases-3和和caspases-7caspases-7誘導凋亡相關誘導凋亡相關的的caspasecaspase級聯(lián)反應。在人類，顆粒酶級聯(lián)反應。在人類，顆粒酶B B還可通過調節(jié)還可通過調節(jié)BIDBID的加工，激活凋亡線粒體通路，放大凋亡信號。的加工，激活凋亡線粒體通路，放大凋亡信號。顆粒酶顆粒酶B B通路通路4.執(zhí)行通路執(zhí)行通路vCaspaseCaspase的發(fā)現(xiàn)源于秀麗隱桿線蟲（的發(fā)現(xiàn)源于秀麗隱桿線蟲（Caenorhabdits Caenorhabdits eleganselegans）細胞凋亡的研究。）細胞凋亡的研究。v現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)caspasecaspase在凋亡過程中發(fā)揮著不同的作用，在凋亡過程中發(fā)揮著不同的作用，可分為兩類：可分為兩類：凋亡的起始者：包括凋亡的起始者：包括caspase-2caspase-2、caspase-8caspase-8、caspase-9caspase-9、caspase-10caspase-10、caspase-11caspase-11；凋亡的執(zhí)行者：包括凋亡的執(zhí)行者：包括caspase-3caspase-3、caspase-6caspase-6、caspase-7caspase-7。（五）凋亡的意義（五）凋亡的意義v細胞凋亡不僅與發(fā)育有關，對于維持機體的平衡及細胞凋亡不僅與發(fā)育有關，對于維持機體的平衡及一些系統(tǒng)的功能達到最佳狀態(tài)，都具有非常重要的意一些系統(tǒng)的功能達到最佳狀態(tài)，都具有非常重要的意義。義。v對于多細胞動物個體，細胞凋亡在胚胎發(fā)育造型，對于多細胞動物個體，細胞凋亡在胚胎發(fā)育造型，細胞數(shù)量的精細調控及潛在危險性細胞的清除方面發(fā)細胞數(shù)量的精細調控及潛在危險性細胞的清除方面發(fā)揮著重要作用。揮著重要作用。凋亡的意義凋亡的意義（六）細胞凋亡與疾?。┘毎蛲雠c疾病v人體細胞凋亡的異常，包括異常的凋亡激活或抑制會引發(fā)多人體細胞凋亡的異常，包括異常的凋亡激活或抑制會引發(fā)多種疾病。種疾病。v細胞凋亡不足會導致腫瘤、自身免疫性疾病。細胞凋亡不足會導致腫瘤、自身免疫性疾病。v細胞的過度凋亡可能是艾滋病、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中和細胞的過度凋亡可能是艾滋病、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中和骨組織病等的發(fā)病機制。骨組織病等的發(fā)病機制。凋亡異常引起并指（趾）凋亡異常引起并指（趾）二、細胞自噬二、細胞自噬v細胞自噬（細胞自噬（autophagyautophagy）是細胞通過溶酶體與雙層膜）是細胞通過溶酶體與雙層膜包裹的細胞自身物質融合，從而降解細胞自身物質包裹的細胞自身物質融合，從而降解細胞自身物質的過程。的過程。v細胞自噬的過程包括膜泡的形成、擴展，自噬體的細胞自噬的過程包括膜泡的形成、擴展，自噬體的形成，自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體形成，自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體（autophagolysosomeautophagolysosome），繼而其內含物被溶酶體中），繼而其內含物被溶酶體中的水解酶消化。的水解酶消化。細胞自噬可分為三種類型細胞自噬可分為三種類型 根據(jù)細胞內底物運送到溶酶體腔方式的不同，哺乳根據(jù)細胞內底物運送到溶酶體腔方式的不同，哺乳動物細胞自噬可分為動物細胞自噬可分為3種主要類型：種主要類型：微自噬（微自噬（micro-autophagy）：）：底物被溶酶體的膜直接底物被溶酶體的膜直接包裹并降解。包裹并降解。巨自噬（巨自噬（macroautophagy）：）：是自噬形式中最普遍的是自噬形式中最普遍的一種。底物被非溶酶體來源的雙層膜包裹，形成自噬泡，在一種。底物被非溶酶體來源的雙層膜包裹，形成自噬泡，在溶酶體中降解。溶酶體中降解。分子伴侶介導的自噬分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）：分子伴侶與底物蛋白分子結合，：分子伴侶與底物蛋白分子結合，與溶酶體膜受體結與溶酶體膜受體結合后，合后，在溶酶體內降解，整個過程不需要囊泡的參與。在溶酶體內降解，整個過程不需要囊泡的參與。v細胞自噬是促使細胞存活的細胞自噬是促使細胞存活的自我保護自我保護機制。機制。v一方面，細胞面臨代謝壓力如營養(yǎng)或生長因子匱一方面，細胞面臨代謝壓力如營養(yǎng)或生長因子匱乏，或處于低氧環(huán)境中，細胞通過降解自身蛋白乏，或處于低氧環(huán)境中，細胞通過降解自身蛋白大分子或細胞器，為細胞生存提供原材料或大分子或細胞器，為細胞生存提供原材料或ATPATP；v另一方面，細胞自噬具有自我另一方面，細胞自噬具有自我“清理清理”功能，與功能，與泛素介導的蛋白降解途徑不同，細胞自噬不僅能泛素介導的蛋白降解途徑不同，細胞自噬不僅能夠降解錯誤折疊的蛋白質多聚物，還能夠降解功夠降解錯誤折疊的蛋白質多聚物，還能夠降解功能失常的整個線粒體、過氧化物酶體、高爾基復能失常的整個線粒體、過氧化物酶體、高爾基復合體等細胞器；甚至可以清除細胞內的病原體。合體等細胞器；甚至可以清除細胞內的病原體。